Epigenetisk regulering av Cardiac Differensiering av embryonale stamceller og vev
Summary
En finjustering regulering av gentranskripsjon ligger under embryonal celle skjebne beslutning. Heri beskriver vi kromatin immunoutfellingsstudier analyser som brukes til å undersøke epigenetisk regulering av både hjerte differensiering av stamceller og hjerte utvikling museembryoer.
Abstract
Spesifikk gentranskripsjon er en viktig biologisk prosess som ligger bak celle skjebne beslutning under embryonal utvikling. Den biologiske prosessen er mediert av transkripsjonsfaktorer som binder genomisk regulatoriske regioner, inkludert forsterkere og arrangører av hjerte konstitutive gener. DNA blir pakket rundt histoner som er utsatt for kjemiske modifikasjoner. Modifikasjoner av histoner videre føre til undertrykte, aktivert eller rustet gentranskripsjon, og dermed bringe et annet nivå av finjustering regulering av gentranskripsjon. Embryonale stamceller (ES-celler) rekapitulere innen embryoid organer (dvs. celleaggregater) eller i 2D kultur de tidlige trinnene i hjerte utvikling. De gir i prinsippet nok materiale til kromatin immunopresipitering (chip), en teknologi bredt anvendt for å identifisere genet regulatoriske områder. Videre humane ES-celler representerer en human cellemodell cardiogenesis. På senere stadier av utvikling, mus embryonale vev tillateundersøker spesifikke epigenetiske landskap som kreves for bestemmelse av celle identitet. Heri beskriver vi protokollene chip, sekvensiell ChIP fulgt av PCR eller brikke-sekvensering ved hjelp av ES-celler, embryoid organer og hjertespesifikke embryonale regioner. Disse protokollene tillater å undersøke epigenetisk regulering av hjerte gentranskripsjon.
Introduction
Hjertet er den første organ som skal dannes og til å bli funksjonell i embryo. Hjertet er bygget fra mange celle linjene som oppstår fra den første og andre embryonale hjerte felt 1. Fra post-fertilisering blastocyststadiet opp til formet hjerte, embryonale celler har dermed gjøre mange celle skjebne beslutninger. Gene transkripsjon er regulert i en tids- og plassavhengig måte og er en viktig biologisk prosess som ligger bak celle skjebne beslutning under embryonal utvikling. En slik prosess er mediert av spesifikke transkripsjonsfaktorer som bindes regulatoriske områder i genomet inkludert stimulerende midler og aktivatorer av hjerte konstitutive gener. DNA blir pakket rundt histoner som er utsatt for modifikasjoner slik som acetylering, metylering, ubiquitinylation, og / eller fosforylering. Histone modifikasjon fører til undertrykte, aktivert eller rustet gentranskripsjon avhengig av hvilken lysinresidiet av histon er endret 2.
jove_content "> Chromatin immunoprecipitation assay (chip) har blitt satt opp år siden 3 og er i dag den mest bredt brukt teknologi for å identifisere mål for enten modifiserte histoner eller transkripsjonsfaktorer fire. Etter immunoprecipitation av histoner eller transkripsjonsfaktorer, kan bindes DNA være enten forsterket ved hjelp av polymerase-kjedereaksjon (PCR) eller sekvensert. Brikken er teknisk overvinne mer utfordrende gelretardasjon assays 5. Men ChIP innebærer ikke direkte binding av en transkripsjonsfaktor på DNA, en fordel ved gelretardasjon assay. på den annen side, spon kombineres for å DNA-sekvensering har åpnet en ny genom-wide perspektiv på genregulering.ES-celler (ES-celler) rekapitulere innen embryoid organer (ie., Celleaggregater) eller i 2D kultur de tidlige trinn av hjerte utvikling 6 og gir i prinsippet nok materiale for chip. Videre humane ES-celler representerer en human cellemodell på ca.rdiogenesis selv om deres kardio potensial avhenger av deres epigenetisk signatur 7. På senere stadier av utvikling, mus embryonale vev tillate for å undersøke bestemte epigenetiske landskap som kreves for bestemmelse av celleidentitet. Imidlertid er genomet transkribert i en tids- og celletype-spesifikk måte 8. Epigenetisk regulering av gentranskripsjon har til å bli studert innenfor lokale områder. Heri beskriver vi protokollene chip, sekvensiell ChIP fulgt av PCR eller sekvensering ved hjelp av ES-celler, embryoid organer og hjertespesifikke embryonale regioner. Disse protokollene tillater å undersøke epigenetisk regulering av hjerte gentranskripsjon.
Protocol
Representative Results
Discussion
Epigenetikk er blitt et viktig forskningsfelt i utviklingsbiologi. Hvor en genetisk program blir aktivert i embryonale celler til å tillate cellene å anskaffe en spesifikk identitet innenfor en embryonisk linjen har i lang tid et viktig spørsmål for utviklings biologer.
Brikken er bredt anvendt i løpet av de siste årene, og kombineres for å DNA-sekvense følgende forbedring i oppløsningen av sekvensering. Dette har blitt en kraftig teknikk for å undersøke i et genom bred avhengig m…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge funding agencies, the IMI StemBANCC European community programme, the leducq Foundation (SHAPEHEART) and the Agence Nationale de la Recherche (Genopath)
Materials
| Formaldehyde | Sigma | F8775 | Cell Fixation |
| Glycine | Sigma | G8898 | Cross-link stop |
| Aprotinin | Fluka | 10820 | Proteases inhibitor |
| Leupeptin hemisulfate | Sigma | L2882 | Proteases inhibitor |
| PMSF | Sigma | P7626 | Proteases inhibitor |
| Protein A magnetic beads | Life technologies | 10001D | Immunoprecipitation |
| SPRI magnetic beads | Thermo Scientific | 15002-01 | DNA purification |
| Proteinase K | Life technologies | 25530-015 | Protein digestion |
| DNA BR standard | Life technologies | Q32850 | Calibration range |
| Syber green | Molecular Probes | S-11484 | DNA quantification |
| TE buffer | Invitrogen | P7589 | DNA quantification |
| PBX 1X | Life technologies | 14190-094 | Washing |
| DNase RNase free water | Life technologies | 10977-035 | Dilution |
| Axygen tube | Axygen | MCT-175-C | ChIP purifiction |
| Antibody | Company | Reference | ChIP concentration |
| H3K27ac | Abcam | ab4729 | 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues |
| H3K4me1 | Diagenode | C15410194 (pAb-194-050) | 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues |
| H3K36me3 | Diagenode | C15410058 (pAb-058-050) | 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues |
| H3K9me2 | Diagenode | C15410060 (pAb-060-050) | 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues |
| H3K4me3 | Diagenode | C15410030 (pAb-030-050) | 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues |
| H3K27me3 | Diagenode | C15410069 (pAb-069-050) | 3 µg for ESC and EBs, 1 µg for tissues |
References
- Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells. Nat Rev Genet. 6, 826-835 (2005).
- Chen, T., Dent, S. Y. Chromatin modifiers and remodellers: regulators of cellular differentiation. Nat Rev Genet. 15, 93-106 (2014).
- Collas, P. The current state of chromatin immunoprecipitation. Mol Biotechnol. 45, 87-100 (2010).
- Gade, P., Kalvakolanu, D. V. Chromatin immunoprecipitation assay as a tool for analyzing transcription factor activity. Methods Mol Biol. 809, 85-104 (2012).
- Scott, V., Clark, A. R., Docherty, K. The gel retardation assay. Methods Mol Biol. 31, 339-347 (1994).
- Van Vliet, P., Wu, S. M., Zaffran, S., Puceat, M. Early cardiac development: a view from stem cells to embryos. Cardiovasc Res. 96, 352-362 (2012).
- Leschik, J., Caron, L., Yang, H., Cowan, C., Puceat, M. A view of bivalent epigenetic marks in two human embryonic stem cell lines reveals a different cardiogenic potential. Stem Cells Dev. 24, 384-392 (2015).
- Bonn, S., Zinzen, R. P., Girardot, C., Gustafson, E. H., Perez-Gonzalez, A., Delhomme, N., Ghavi-Helm, Y., Wilczynski, B., Riddell, A., Furlong, E. E. Tissue-specific analysis of chromatin state identifies temporal signatures of enhancer activity during embryonic development. Nat Genet. 44, 148-156 (2012).
- Kim, T. K., Shiekhattar, R. Architectural and Functional Commonalities between Enhancers and Promoters. Cell. 162, 948-959 (2015).
- Abboud, N., Moore-Morris, T., Hiriart, E., Yang, H., Bezerra, H., Gualazzi, M. G., Stefanovic, S., Guenantin, A. C., Evans, S. M., Puceat, M. A cohesin-OCT4 complex mediates Sox enhancers to prime an early embryonic lineage. Nat Commun. 6, 6749 (2015).
- Dahl, J. A., Collas, P. Q2ChIP, a quick and quantitative chromatin immunoprecipitation assay, unravels epigenetic dynamics of developmentally regulated genes in human carcinoma cells. Stem Cells. 25, 1037-1046 (2007).
- Bernstein, B. E., Mikkelsen, T. S., Xie, X., Kamal, M., Huebert, D. J., Cuff, J., Fry, B., Meissner, A., Wernig, M., Plath, K., et al. A bivalent chromatin structure marks key developmental genes in embryonic stem cells. Cell. 125, 315-326 (2006).
- Wamstad, J. A., Alexander, J. M., Truty, R. M., Shrikumar, A., Li, F., Eilertson, K. E., Ding, H., Wylie, J. N., Pico, A. R., Capra, J. A., et al. Dynamic and coordinated epigenetic regulation of developmental transitions in the cardiac lineage. Cell. 151, 206-220 (2012).
- Stergachis, A. B., Neph, S., Reynolds, A., Humbert, R., Miller, B., Paige, S. L., Vernot, B., Cheng, J. B., Thurman, R. E., Sandstrom, R., et al. Developmental fate and cellular maturity encoded in human regulatory DNA landscapes. Cell. 154, 888-903 (2013).
- Brind’Amour, J., Liu, S., Hudson, M., Chen, C., Karimi, M. M., Lorincz, M. C. An ultra-low-input native ChIP-seq protocol for genome-wide profiling of rare cell populations. Nat Commun. 6, 6033 (2015).
