अलगाव और zebrafish भ्रूण से एकल कक्ष की विशेषता
Summary
This protocol describes a method for isolating single cells from zebrafish embryos, enriching for cells of interest, capturing zebrafish cells in microfluidic based single cell multiplex systems, and assessing gene expression from single cells.
Abstract
The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been described at the morphological level, little is known about the molecular basis of cellular changes that occur as the organism develops. With recent advancements in microfluidics and multiplexing technologies, it is now possible to characterize gene expression in single cells. This allows for investigation of heterogeneity between individual cells of specific cell populations to identify and classify cell subtypes, characterize intermediate states that occur during cell differentiation, and explore differential cellular responses to stimuli. This study describes a protocol to isolate viable, single cells from zebrafish embryos for high throughput multiplexing assays. This method may be rapidly applied to any zebrafish embryonic cell type with fluorescent markers. An extension of this method may also be used in combination with high throughput sequencing technologies to fully characterize the transcriptome of single cells. As proof of principle, the relative abundance of cardiac differentiation markers was assessed in isolated, single cells derived from nkx2.5 positive cardiac progenitors. By evaluation of gene expression at the single cell level and at a single time point, the data support a model in which cardiac progenitors coexist with differentiating progeny. The method and work flow described here is broadly applicable to the zebrafish research community, requiring only a labeled transgenic fish line and access to microfluidics technologies.
Introduction
सेल और आणविक जीव विज्ञान के अध्ययन के सबसे वर्तमान जनसंख्या का औसत पर आधारित हैं। हालांकि, महत्वपूर्ण जैविक घटनाओं इन पारंपरिक जनसंख्या के आधार पर विश्लेषण द्वारा नकाबपोश जा सकता है के बाद से नाबालिग आबादी जैविक प्रक्रियाओं और रोग परिणाम में प्रमुख भूमिका निभा सकते हैं। एकल कोशिका के स्तर पर विषम आबादी में जीन की अभिव्यक्ति को समझना (और है) प्रासंगिक जैविक और नैदानिक अंतर्दृष्टि 1,2 करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। भ्रूण के विकास के अध्ययन के लिए चिंता का विषय है, कोशिकाओं की एक बड़ी आबादी में, पूर्वज कोशिकाओं अक्सर underrepresented कर रहे हैं, यह चुनौतीपूर्ण जीन अभिव्यक्ति में सूक्ष्म परिवर्तन है कि अंततः सेल भाग्य का निर्णय 3 आरंभ पता लगाने के लिए कर रही है। इसी तरह, एक एकल कोशिका प्रकार microenvironment 4 के जवाब में अलग अभिव्यक्ति प्रोफाइल हो सकता है। उदाहरण के लिए, (जैसे।, महाधमनी या गुर्दे) एक ही अंग में या विभिन्न अंगों में निवासी endothelial कोशिकाओं आम morp साझा करने के बावजूद महत्वपूर्ण विविधता का प्रदर्शनhological और कार्यात्मक सुविधाओं 5। इसके अलावा, एक ही कैंसर ट्यूमर कोशिकाओं को भी populating एकल कोशिका के स्तर 6 पर आणविक प्रोफाइल या म्यूटेशन अलग-अलग हो सकता है।
मॉडल प्रणाली में, एकल कक्षों में transcriptomics सफलतापूर्वक नए सेल आबादी की पहचान की है, मध्यवर्ती कहा गया है कि सेल भेदभाव के दौरान होने की विशेषता है, और 7,8,9 उत्तेजनाओं को अंतर सेलुलर प्रतिक्रियाओं का पता चला। इस तरह की अंतर्दृष्टि पारंपरिक जनसंख्या आधारित अध्ययन में नकाबपोश गया होता। Zebrafish भ्रूण स्टेम, पूर्वज का एक काफी कम उपयोग स्रोत हैं, और विकास के दौरान एकल कक्ष विविधता और सेलुलर पहचान की आणविक विनियमन के सवालों की खोज के लिए कोशिकाओं का फर्क। उनके अत्यधिक टकसाली, पूर्व vivo विकास और आनुवंशिक हेरफेर की आसानी उन्हें इस दृष्टिकोण 10,11 के लिए एक शानदार मॉडल प्रणाली बनाते हैं। विशेष रूप से, एकल कोशिका जनरल की व्याख्या करने के लिए एक प्रमुख सीमाई अभिव्यक्ति डेटा है कि विकास के दौरान उपन्यास मध्यवर्ती सेल राज्यों के विश्वसनीय पहचान ऊतक संग्रह 9 की बहुत सावधान समय की आवश्यकता है। यह सुनिश्चित करना है कि कब्जा कर लिया कोशिकाओं के बीच विविधता उम्र पर निर्भर सेल भेदभाव द्वारा प्रस्तुत जीन अभिव्यक्ति में एक भी समय बिंदु पर बजाय विविधता एक ऊतक के भीतर विविधता का प्रतिनिधित्व आवश्यक है। चूहों की तुलना में, zebrafish भ्रूण विकास के ठीक 12 भ्रूण की एक बड़ी संख्या में सिंक्रनाइज़ किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, बड़े क्लच आकार के साथ, zebrafish भ्रूण स्टेम कोशिकाओं और पूर्वज का एक प्रचुर स्रोत के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।
इस प्रोटोकॉल zebrafish भ्रूण से कोशिकाओं को अलग और QRT- पीसीआर जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एकीकृत microfluidics सर्किट (आईएफसी) चिप और autoprep प्रणाली का उपयोग करते हुए एकल कक्षों पर कब्जा करने के लिए एक विधि का वर्णन है। इस प्रोटोकॉल तेजी से पूरे सहित किसी भी उच्च throughput बहुसंकेतन assays के लिए संक्रमणीय हो सकता हैtranscriptome अनुक्रमण कि सेलुलर विविधता 13 के अधिक व्यापक विश्लेषण की अनुमति देता है। यह भी पारंपरिक जीन अभिव्यक्ति assays के लिए कई लाभ प्रदान करता है। एकल कक्ष अलगाव प्रोटोकॉल FACS के बाद उच्च व्यवहार्यता, जो समझौता कोशिकाओं है कि बहाव के अनुप्रयोगों में शामिल हैं के अनुपात में कम हो जाती है अर्जित करता है। एक आईएफसी का उपयोग करके, पर कब्जा कर लिया कोशिकाओं को सीधे कब्जा दरों का मूल्यांकन करने और आकृति विज्ञान सेल स्वास्थ्य का आकलन करने के लिए मनाया जा सकता है। इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल केवल एक लेबल ट्रांसजेनिक मछली लाइन और microfluidic सेल प्रौद्योगिकियों पर कब्जा करने के लिए उपयोग की आवश्यकता होती है, मोटे तौर पर zebrafish अनुसंधान समुदाय के लिए लागू है।
सिद्धांत के सबूत के रूप में, हृदय progenitors से निकाली गई एकल कक्षों अलग थे और एक आईएफसी चिप पर कब्जा कर लिया है, और फिर हृदय भेदभाव मार्करों के रिश्तेदार बहुतायत QRT- पीसीआर द्वारा मापा गया था। एकल कोशिका के स्तर पर जीन एक्सप्रेशन विश्लेषण दर्शाता है कि हृदय progenitors उनकी विभिन्न साथ साथ रहntiating संतान। अंतर्दृष्टि हृदय progenitors के एकल कोशिका की रूपरेखा से प्राप्त कशेरुकी विकास के दौरान हृदय पूर्वज कोशिकाओं के बीच जीन अभिव्यक्ति पैटर्न में विविधता है, जो पारंपरिक जनसंख्या के आधार पर विश्लेषण में नकाबपोश गया हो सकता है पर प्रकाश डाला सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
विधि वर्णित एक सेल प्रकार विशिष्ट प्रमोटर के नियंत्रण के तहत एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन की अभिव्यक्ति का उपयोग करता microfluidic सहायता एकल कक्ष पर कब्जा प्रणाली में इस्तेमाल के लिए zebrafish भ्रूण से हृदय पूर्वज कोशि?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. C. Geoffrey Burns for fish stock. The authors are grateful to UNC Flow Cytometry Core Facility, UNC-CGIBD AAC core for resources enabling this project, and the ZAC facility for animal care. L.S. is supported by NIH T32 grant HL069768-13 (PI, Nobuyo Maeda). N.F. is supported by NSF Graduate Research Fellowship NSF-DGE-1144081. This study was supported by NIH P30DK034987 grant (to UNC Advanced Analytics Core), American Heart Association Scientist Development Grant 13SDG17060010 and Ellison Medical Foundation New Scholar Grant AG-NS-1064-13 (to Dr. Qian), and NIH R00 HL109079 grant (to Dr. Liu).
Materials
| Supplies | |||
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | For removing the chorion from embryos |
| Microcentrifuge tube 2 mL | GeneMate | C-3261-1 | |
| 40 um cell strainer | Biobasic | SP104151 | |
| 35 mm culture dish | Falcon | 351008 | |
| FACS tubes topped with 35 um cell strainer | Falcon | 352235 | |
| P1000 and tips | Rainin | 17005089 | |
| P20 and tips | Rainin | 17005091 | |
| IFC chip manufacturer's protocol | Fluidigm | 100-6117 | Version 100-6117 E1 was used in representative experiment |
| Wide bore pastuer glass pippette | VWR | 14673-010 | For transferring embryos |
| Adult wild type zebrafish | N/A | We used AB line | |
| Adult transgenic zebrafish | N/A | We used Tg(nkx2.5:ZsYellow) | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents for cell dissociation | |||
| Double distilled water | N/A | ||
| Instant Ocean Sea Salt | Instant Ocean | SS15-10 | |
| NaCl | FisherScientific | S271-3 | make stock in water and use for de-yolking buffer |
| KCl | Sigma Aldrich | P5405 | make stock in water and use for de-yolking buffer |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S6014 | make stock in water and use for de-yolking buffer |
| Leibovitz's L-15 | Gibco | 21083-027 | |
| FBS | FisherScientific | 03-600-511 | Heat inactivate; any brand of FBS should be fine |
| Cell Dissociation Reagent 1 -TrypLE | Life Technologies | 12605-010 | Store at room temperature. |
| Cell Dissociation Reagent 2 – FACSmax | Genlantis | T200100 | Store -20; thaw on ice; bring to room temp before use |
| pronase (optional) | Sigma | P5147 | |
| L/D Dye – Sytox Blue | Life Technologies | S34857 | Any live/dead stain suitable for flow cytometry will work |
| Trypan Blue | Gibco | 15250-061 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents for IFC plate use and qRT-PCR | |||
| Gene-specific probes | Probes will vary by experiment | ||
| TaqMan Probe ef1a | Life Technologies | Dr03432748_m1 | |
| TaqMan Probe gata4 | Life Technologies | Dr03443262_g1 | |
| TaqMan Probe nk2-5 | Life Technologies | Dr03074126_m1 | |
| TaqMan Probe myl7 | Life Technologies | Dr03105700_m1 | |
| TaqMan Probe vmhc | Life Technologies | Dr03431136_m1 | |
| TaqMan Probe isl1 | Life Technologies | Dr03425734_m1 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Life Technologies | 4369016 | |
| Reagents listed in IFC manufacturer's protocol | |||
| C1 Reagent Kit | Fluidigm | 100-5319 | Reagents for loading cells onto IFC plate |
| Ambion Single Cell-to-CTTM | Life Technologies | 4458237 | Reagents for reverse transcription and pre-amplification steps |
| Molecular Biology Quality Water | Corning | 46-000CM | |
| C1 IFC for PreAmp (5-10 um) | Fluidigm | 100-5757 | IFC plate for small cells |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| C1 AutoPrep machine | Fluidigm | 100-5477 | For IFC plate use |
| Hemocytometer | Sigma Aldrich | Z359629 | For counting cells and assessing cell size |
| Dissecting microscope | For removing embryos from chorion | ||
| Tissue culture microscope | For assessing single cell digestion | ||
| FACS machine | For isolating cells of interest |
References
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