ゼブラフィッシュ胚からの単一細胞の単離とキャラクタリゼーション
Summary
This protocol describes a method for isolating single cells from zebrafish embryos, enriching for cells of interest, capturing zebrafish cells in microfluidic based single cell multiplex systems, and assessing gene expression from single cells.
Abstract
The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been described at the morphological level, little is known about the molecular basis of cellular changes that occur as the organism develops. With recent advancements in microfluidics and multiplexing technologies, it is now possible to characterize gene expression in single cells. This allows for investigation of heterogeneity between individual cells of specific cell populations to identify and classify cell subtypes, characterize intermediate states that occur during cell differentiation, and explore differential cellular responses to stimuli. This study describes a protocol to isolate viable, single cells from zebrafish embryos for high throughput multiplexing assays. This method may be rapidly applied to any zebrafish embryonic cell type with fluorescent markers. An extension of this method may also be used in combination with high throughput sequencing technologies to fully characterize the transcriptome of single cells. As proof of principle, the relative abundance of cardiac differentiation markers was assessed in isolated, single cells derived from nkx2.5 positive cardiac progenitors. By evaluation of gene expression at the single cell level and at a single time point, the data support a model in which cardiac progenitors coexist with differentiating progeny. The method and work flow described here is broadly applicable to the zebrafish research community, requiring only a labeled transgenic fish line and access to microfluidics technologies.
Introduction
細胞及び分子生物学の最新の研究は、母集団平均に基づいています。マイナー集団は生物学的プロセスおよび疾患の結果で主要な役割を再生することができますので、重要な生物学的事象は、これらの伝統的な集団ベースの分析によってマスクすることができます。関連する生物学的および臨床的洞察1,2につながる（たと）単一細胞レベルでの不均一な集団における遺伝子発現をすることができます理解します。胚発生の研究に懸念されるのは、細胞の大きな集団において、前駆細胞は、それが困難な、最終的に細胞の運命の決定3を開始し 、遺伝子発現の微妙な変化を検出すること、しばしば過小評価されています。同様に、単一の細胞型は、微小環境4に対応して異なる発現プロファイルを有することができます。たとえば、同じ器官または異なる器官内に常駐内皮細胞（ 例えば 、大動脈または腎臓）は、共通のmorpを共有するにもかかわらず、有意な異質性を示しますhologicalおよび機能的特徴5。また、同じ腫瘍を移植癌細胞は、単一細胞レベルでの6分子プロフィールまたは突然変異を変化させることができます。
モデル系では、単一細胞におけるトランスクリプトが正常に、新しい細胞集団を同定し、細胞分化の間に生じる中間状態を特徴づけ、そして7,8,9を刺激するために、差動細胞応答を明らかにしました。このような洞察は、従来の集団ベースの研究でマスクされていたであろう。ゼブラフィッシュの胚は、単一の細胞の不均一や開発中の細胞のアイデンティティの分子調節の質問を探索するための幹細胞、前駆細胞、および分化する細胞の途方もなく過小利用源です。彼らの非常にステレオタイプ、ex vivoでの開発や遺伝子操作の容易さは、それらのこのアプローチ10,11のための優れたモデル系にします。具体的には、単一のセル世代の解釈に大きな制限Eの発現データは、開発中の新規な中間体セル状態の信頼性の識別は、組織収集9の非常に慎重にタイミングを必要とすることです。これは、捕捉された細胞との間の不均一性は、年齢依存性細胞分化によって提示される遺伝子発現における単一の時点で組織内の不均一ではなく、不均一性を表していることを保証する必要があります。マウスと比較して、ゼブラフィッシュ胚発生を正確に胚12の多数にわたって同期させることができます。さらに、大規模なクラッチサイズで、ゼブラフィッシュの胚は、幹細胞および前駆細胞の豊富な供給源として使用することができます。
このプロトコルは、ゼブラフィッシュ胚からの細胞を単離し、市販の集積マイクロ流体回路のqRT-PCR遺伝子発現解析のために（IFC）チップとオートプレップシステムを用いて単一細胞を捕捉する方法を記載します。このプロトコルは、全体を含む任意の高スループット多重アッセイに急速に譲渡することができます細胞異質13のより包括的な分析を可能にするトランスクリプトーム配列決定。また、伝統的な遺伝子発現アッセイにいくつかの利点を提供しています。単一細胞単離プロトコールは、下流アプリケーションに含まれている妥協細胞の割合を減少さFACS、後に高い生存率をもたらします。 IFCを使用することにより、捕捉された細胞を直接捕捉率を評価し、形態学的細胞の健康を評価するために観察することができます。また、このプロトコルは、マイクロ流体細胞捕捉技術にのみラベルされたトランスジェニック魚のラインとのアクセスを必要とする、ゼブラフィッシュ研究コミュニティに広く適用可能です。
原理の証明として、心臓前駆細胞に由来する単一の細胞を単離し、IFCチップ上に捕捉し、次いで心臓分化マーカーの相対的存在量は、定量RT-PCRにより測定しました。単一細胞レベルでの遺伝子発現解析は、心臓前駆体が自分のdiffereと共存することを実証しますntiating子孫。心臓前駆体の単一細胞プロファイリングから得られた知見は、伝統的な集団ベースの解析でマスクされている可能性があり、脊椎動物の発生時に心臓前駆細胞間の遺伝子発現パターンの不均一性、に光を当てることがあります。
Protocol
Representative Results
Discussion
本明細書に記載される方法は、単一の心臓遺伝子のサブセットの発現を評価するために、マイクロ流体アシスト単一細胞捕捉システムで使用するためのゼブラフィッシュ胚からの心臓前駆細胞の集団を濃縮するために細胞型特異的プロモーターの制御下で蛍光タンパク質の発現を使用して細胞。 FACSレーザ励起と発光の機能が選択されたフルオロフォア（複数可）と適合することを、この方?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. C. Geoffrey Burns for fish stock. The authors are grateful to UNC Flow Cytometry Core Facility, UNC-CGIBD AAC core for resources enabling this project, and the ZAC facility for animal care. L.S. is supported by NIH T32 grant HL069768-13 (PI, Nobuyo Maeda). N.F. is supported by NSF Graduate Research Fellowship NSF-DGE-1144081. This study was supported by NIH P30DK034987 grant (to UNC Advanced Analytics Core), American Heart Association Scientist Development Grant 13SDG17060010 and Ellison Medical Foundation New Scholar Grant AG-NS-1064-13 (to Dr. Qian), and NIH R00 HL109079 grant (to Dr. Liu).
Materials
| Supplies | |||
| Dumont #5 forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | For removing the chorion from embryos |
| Microcentrifuge tube 2 mL | GeneMate | C-3261-1 | |
| 40 um cell strainer | Biobasic | SP104151 | |
| 35 mm culture dish | Falcon | 351008 | |
| FACS tubes topped with 35 um cell strainer | Falcon | 352235 | |
| P1000 and tips | Rainin | 17005089 | |
| P20 and tips | Rainin | 17005091 | |
| IFC chip manufacturer's protocol | Fluidigm | 100-6117 | Version 100-6117 E1 was used in representative experiment |
| Wide bore pastuer glass pippette | VWR | 14673-010 | For transferring embryos |
| Adult wild type zebrafish | N/A | We used AB line | |
| Adult transgenic zebrafish | N/A | We used Tg(nkx2.5:ZsYellow) | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents for cell dissociation | |||
| Double distilled water | N/A | ||
| Instant Ocean Sea Salt | Instant Ocean | SS15-10 | |
| NaCl | FisherScientific | S271-3 | make stock in water and use for de-yolking buffer |
| KCl | Sigma Aldrich | P5405 | make stock in water and use for de-yolking buffer |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S6014 | make stock in water and use for de-yolking buffer |
| Leibovitz's L-15 | Gibco | 21083-027 | |
| FBS | FisherScientific | 03-600-511 | Heat inactivate; any brand of FBS should be fine |
| Cell Dissociation Reagent 1 -TrypLE | Life Technologies | 12605-010 | Store at room temperature. |
| Cell Dissociation Reagent 2 – FACSmax | Genlantis | T200100 | Store -20; thaw on ice; bring to room temp before use |
| pronase (optional) | Sigma | P5147 | |
| L/D Dye – Sytox Blue | Life Technologies | S34857 | Any live/dead stain suitable for flow cytometry will work |
| Trypan Blue | Gibco | 15250-061 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents for IFC plate use and qRT-PCR | |||
| Gene-specific probes | Probes will vary by experiment | ||
| TaqMan Probe ef1a | Life Technologies | Dr03432748_m1 | |
| TaqMan Probe gata4 | Life Technologies | Dr03443262_g1 | |
| TaqMan Probe nk2-5 | Life Technologies | Dr03074126_m1 | |
| TaqMan Probe myl7 | Life Technologies | Dr03105700_m1 | |
| TaqMan Probe vmhc | Life Technologies | Dr03431136_m1 | |
| TaqMan Probe isl1 | Life Technologies | Dr03425734_m1 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Life Technologies | 4369016 | |
| Reagents listed in IFC manufacturer's protocol | |||
| C1 Reagent Kit | Fluidigm | 100-5319 | Reagents for loading cells onto IFC plate |
| Ambion Single Cell-to-CTTM | Life Technologies | 4458237 | Reagents for reverse transcription and pre-amplification steps |
| Molecular Biology Quality Water | Corning | 46-000CM | |
| C1 IFC for PreAmp (5-10 um) | Fluidigm | 100-5757 | IFC plate for small cells |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| C1 AutoPrep machine | Fluidigm | 100-5477 | For IFC plate use |
| Hemocytometer | Sigma Aldrich | Z359629 | For counting cells and assessing cell size |
| Dissecting microscope | For removing embryos from chorion | ||
| Tissue culture microscope | For assessing single cell digestion | ||
| FACS machine | For isolating cells of interest |
References
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