في المختبر التفكيك من الأنفلونزا من الفيروسات Capsids بواسطة الطرد المركزي التدرج
Summary
Disassembly of influenza A virus cores during virus entry into host cells is a multistep process. We describe an in vitro method to analyze the early stages of viral uncoating. In this approach, velocity gradient centrifugation is used to biochemically dissect the steps that initiate uncoating under defined conditions.
Abstract
Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus (IAV), virus fusion with the endosomal membrane as well as the subsequent disassembly of the viral capsid, called uncoating, is governed by the ionic conditions inside endocytic vesicles. The early steps in the virus life cycle are hard to study because endosomes cannot be directly accessed experimentally, creating the need for an in vitro approach. Here, we describe a method based on velocity gradient centrifugation of purified virions through a two-layer glycerol gradient, which enables analysis of the IAV core and its stability. The gradient contains a non-ionic detergent (NP-40) in its lower layer to remove the viral membrane by solubilization as the virus sediments toward the bottom. At neutral pH, viral cores are pelleted as stable structures. The major core components, matrix protein (M1) and the viral ribonucleoproteins (vRNPs), can be clearly identified in the pellet fraction by SDS-PAGE. Decreasing the pH to 6.0 or lower in the bottom layer selectively removes M1 from the pellet followed by release of vRNPs at more acidic conditions. Viral protein bands on Coomassie-stained gels can be subjected to densitometric quantification to monitor intermediate states of IAV disassembly. Besides pH, other factors that influence viral core stability can be assessed, such as salt concentration and putative viral uncoating factors, simply by modifying the detergent-containing glycerol layer accordingly. Taken together, the presented technique allows highly reproducible and quantitative analysis of viral uncoating in vitro. It can be applied to other enveloped viruses that undergo complex uncoating processes.
Introduction
فيروس الانفلونزا (IAV) هو فيروس يلفها وينتمي إلى عائلة فيروسات مخاطية قويمة. يتم ترميز جيناته على مجزأة، السلبي، بمعنى واحد الذين تقطعت بهم السبل جينوم الحمض النووي الريبي. في البشر، IAV يسبب التهابات الجهاز التنفسي، والتي تحدث في تفشي وباء الموسمية ويحمل احتمالات الأوبئة العالمية 1. على الربط إلى بقايا حمض اللعابي على سطح الخلية المضيفة 2، والمنضوية IAV بواسطة الإلتقام تعتمد على بالكلاذرين ومسارات مستقلة بالكلاذرين 3-8. الوسط الحمضي (درجة الحموضة <5.5) في فجوات التقامي يتسبب في تغيير متعلق بتكوين رئيسيا في IAV ارتفاع بروتين سكري هيماغلوتينين (HA)، مما يؤدي إلى انصهار الفيروسية والراحل endosomal غشاء 9. مرة واحدة قفيصة IAV (كما يشار إليها هنا ب "الأساسية" الفيروسي) قد فر من الإندوسومات أواخر (ليه)، وغير المصقول في العصارة الخلوية تليها النقل من ribonucleoproteins الفيروسية (vRNPs) في نواة – موقع ستكاثر الفيروس و والنسخ 10-13. قبل تفعيل حمض HA الفيروس يواجه انخفاض تدريجي في درجة الحموضة في النظام التقامي، الذي يعبي الأساسية للتفكك اللاحق 14-16. في هذا "فتيلة" خطوة القنوات الأيونية M2 في الغشاء الفيروسي توسط في تدفق البروتونات وK +10،14،16. التغير في تركيز الأيونية في الداخل فيروس يزعج التفاعلات تراكم من البروتين مصفوفة الفيروسي M1 وحزمة vRNP ثمانية، ويسهل IAV uncoating في السيتوبلازم التالية الغشاء الانصهار 10،14-17.
وقد أعاق تحليل مباشر والكمي للخطوة فتيلة من حقيقة أن الإندوسومات يصعب الوصول تجريبيا. كانت عملية الإدخال، وعلاوة على ذلك، إلى حد كبير غير متزامن. وبالإضافة إلى ذلك، المقايسات نقطة النهاية، مثل QRT-PCR RNA من القياسات أو العدوى الفيروسية المفرج عنهم، لا تقدم صورة تفصيلية عن الحالة البيوكيميائية للcapsi الفيروسيةد في أي خطوة معينة من الدخول. في حين اضطراب الإندوسومات من سيرنا أو العلاج من تعاطي المخدرات ساهم بشكل كبير في فهم دخول IAV 18-20، صقل صعب وعرضة لآثار جانبية غير محددة في برنامج الاندوسوم النضج لرقابة مشددة.
لتجنب هذه المشاكل، ونحن تكيفت لفي المختبر بروتوكول سبق وضعها على أساس استخدام سرعة التدرج الطرد المركزي 17. وعلى النقيض من المحاولات الأخرى 21،22، 23،24، التي استندت في معظمها على مزيج من انشقاق بروتين والعلاج المنظفات تليها تحليل EM، مكن هذا النهج نتيجة قابلة للقياس بسهولة. الطرد المركزي من خلال طبقات متدرجة مختلفة يسمح الجسيمات المترسبة إلى أن تتعرض لوتتفاعل مع الظروف المتغيرة في الطريقة التي تسيطر عليها. في بروتوكول المعروضة، IAV المستمدة من السوائل السقاء توضيح أو الجسيمات الفيروسية النقاء والرسوبية إلى الجلسرين من طبقتينالتدرج التي تحتوي الطبقة السفلى المنظفات غير الأيونية NP-40 (الشكل 1). كما يدخل الفيروس الثانية، طبقة التي تحتوي على مواد التنظيف، وبالفاعلات والفيروسية المغلف الدهون والبروتينات السكرية المغلف بلطف وتركت وراءها. جوهر، ويتألف من vRNP حزمة ثمانية ومحاطة بطبقة مصفوفة والرواسب بمثابة هيكل مستقر في جزء بيليه. البروتينات الأساسية الفيروسية، مثل M1 والبروتين النووي المرتبطة vRNP (NP)، يمكن تحديدها في بيليه بواسطة SDS-PAGE وCoomassie تلطيخ. على وجه الخصوص، والاستفادة من المواد الهلامية التدرج المتاحة تجاريا وتلطيخ مع الغروية حساسة للغاية Coomassie 25، وتمكن عالية الدقة وكشف حتى كميات صغيرة من البروتينات المرتبطة الأساسية الفيروسية.
هذا يضع أساسا لاختبار ما إذا كانت الظروف مختلفة مثل درجة الحموضة، تركيز الملح، والعوامل uncoating المفترضة لها آثار على سلوك الترسيب من المكونات الأساسية وSTABIL الأساسية إيتي. لتحقيق هذا الهدف، يتم تعديل فقط، الطبقة السفلى التي تحتوي على مواد التنظيف في التدرج الجلسرين عن طريق إدخال عامل أو شرط من الفائدة. وكانت هذه التقنية قيمة خاصة في التحقيق في تأثير القيم الرقم الهيدروجيني وتركيز الملح مختلفة على سلامة جوهر IAV 16. يمكن رصد الخطوات الوسيطة من IAV uncoating بما في ذلك تفكك طبقة المصفوفة في درجة الحموضة الحمضية أقل ما يقال (<6.5)، يليه vRNP التفكك في الرقم الهيدروجيني 5.5 وانخفاض 16،17 (الشكل 1). وتعززت الخطوة الأخيرة أبعد من ذلك وجود ارتفاع K + التركيز في طبقة الجلسرين، والتي تعكس بيئة التقامي أواخر 16. وبالتالي، بأنه الفيروس وجوهر الرسوبية من خلال التدرج أنها شهدت بيئة المتغيرة التي يحاكي الظروف في الإندوسومات. وكانت النتيجة التفكيك التدريجي للالأساسية الفيروسي في المختبر، واستكمال النتائج المستمدة من المقايسات بيولوجيا الخلية.
ر "> وقد مكن الطريقة المعروضة هنا سريع وتحليل تكرار للغاية من IAV (X31) و (A / WSN / 33) وIBV (B / لي / 40) uncoating الناجمة عن الحامضية وزيادة K +16،17 فضلا عن التفكيك من النوى الفيروسة المخاطانية على قلوية درجة الحموضة تعرض 17. فمن المتصور أن النهج يمكن أن تتكيف مع الفيروسات يلفها أخرى لاكتساب نظرة ثاقبة الخصائص الكيميائية الحيوية للهيكل قفيصة الفيروسية والتفكيك القفيصة أثناء دخول الخلية.Protocol
Representative Results
Discussion
capsids الفيروسية المجمعات الجزيئات متبدل الاستقرار. في حين تجميع virions يتطلب encapsidation والتكثيف من الجينوم فيروس، بدء الجولة القادمة من عدوى يعتمد على تفكيك هذه البنية القفيصة المضغوط. وقد تطورت الفيروسات لاستغلال الآليات الخلوية المختلفة للسيطرة على دورة طلاء uncoating، بم?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر يوهي ياموتشي وروبرتا مانشيني لتزويدنا الكواشف. وأيد المختبر ه من قبل ماري كوري شبكة التكوين الأولي (آي تي)، والمجلس الأوروبي للبحوث (ERC)، ومؤسسة العلوم الوطنية السويسرية (SINERGIA).
Materials
| cOmplete™, EDTA-free protease inhibitor tablets | Sigma-Aldrich | 11873580001 | The stock solution can be stored at 2 to 8 °C for 1 to 2 weeks |
| Glacial acetic acid | Merck Millipore | 100063 | |
| Glycerol anhydrous BioChemica | AppliChem | A1123 | |
| Hydrochloric acid | Merck Millipore | 100317 | |
| Long injection needle (21 GA, 9 cm, bevel or blunt-end) | |||
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | M8250 | |
| Methanol | Merck Millipore | 106009 | |
| NP-40 | Sigma-Aldrich | I8896 | Now commercially available as IGEPAL® CA-630 |
| NuPAGE® 4-12% Bis-Tris mini gels, 10 wells, 1.0 mm | Life Technologies | NP0321 | |
| NuPAGE® LDS sample buffer (4X) | Life Technologies | NP0008 | |
| NuPAGE® MOPS SDS running buffer (20X) | Life Technologies | NP0001 | |
| pH indicator strips, pH 4.0 – 7.0 | Merck Millipore | 109542 | |
| QC Colloidal Coomassie Stain | BIO RAD | 1610803 | |
| Sodium chloride | Merck Millipore | 106406 | |
| Sodiumhydroxide | Merck Millipore | 106498 | |
| Steritop™ filter unit | Merck Millipore | SCGPT05RE | |
| SW41 Ti, ultracentrifuge rotor set | Beckman Coulter | 331336 | |
| Thinwall, Ultra-clear centrifuge tubes, 13.2 ml, 14 x 89 mm | Beckman Coulter | 344059 | |
| Tris hydrochloride | AppliChem | A1087 | |
| X31 Influenza A virus (H3N2), egg-grown, clarified allantoic fluid | Virapur | Freshly thawed on 4°C |
References
- Taubenberger, J. K., Kash, J. C. Influenza Virus Evolution, Host Adaptation, and Pandemic Formation. Cell host & microbe. 7 (6), 440-451 (2010).
- Skehel, J. J., Wiley, D. C. Receptor binding and membrane fusion in virus entry: the influenza hemagglutinin. Annual review of biochemistry. 69, 531-569 (2000).
- de Vries, E., et al. Dissection of the influenza a virus endocytic routes reveals macropinocytosis as an alternative entry pathway. PLoS pathogens. 7 (3), e1001329 (2011).
- Matlin, K. S., Reggio, H., Helenius, A., Simons, K. Infectious entry pathway of influenza virus in a canine kidney cell line. J Cell Biol. 91 (3 Pt 1), 601-613 (1981).
- Patterson, S., Oxford, J. S., Dourmashkin, R. R. Studies on the mechanism of influenza virus entry into cells. J Gen Virol. 43 (1), 223-229 (1979).
- Rust, M. J., Lakadamyali, M., Zhang, F., Zhuang, X. Assembly of endocytic machinery around individual influenza viruses during viral entry. Nat Struct Mol Biol. 11 (6), 567-573 (2004).
- Sieczkarski, S. B., Whittaker, G. R. Dissecting virus entry via endocytosis. J Gen Virol. 83 (Pt 7), 1535-1545 (2002).
- Yoshimura, A., et al. Infectious Cell Entry Mechanism of Influenza Virus. Journal of Virology. 43 (1), 284-293 (1982).
- White, J., Kartenbeck, J., Helenius, A. Membrane-fusion activity of influenza virus. Embo Journal. 1 (2), 217-222 (1982).
- Martin, K., Helenius, A. Nuclear transport of influenza virus ribonucleoproteins: The viral matrix protein (M1) promotes export and inhibits import. Cell. 67 (1), 117-130 (1991).
- Palese, P., Shaw, M. L., Knipe, D. M., Howley, P. M. Chapter 47. Fields Virology. , 1647-1690 (2006).
- Chou, Y. -. Y., et al. Colocalization of Different Influenza Viral RNA Segments in the Cytoplasm before Viral Budding as Shown by Single-molecule Sensitivity FISH Analysis. PLoS Pathog. 9 (5), e1003358 (2013).
- Martin, K., Helenius, A. Transport of incoming influenza virus nucleocapsids into the nucleus. Journal of Virology. 65 (1), 232-244 (1991).
- Bui, M., Whittaker, G., Helenius, A. Effect of M1 protein and low pH on nuclear transport of influenza virus ribonucleoproteins. Journal of Virology. 70 (12), 8391-8401 (1996).
- Li, S., et al. pH-Controlled Two-Step Uncoating of Influenza Virus. Biophysical Journal. 106 (7), 1447-1456 (2014).
- Stauffer, S., et al. Stepwise priming by acidic pH and high K+ is required for efficient uncoating of influenza A virus cores after penetration. Journal of Virology. , (2014).
- Zhirnov, O. P. Solubilization of matrix protein M1/M from virions occurs at different pH for orthomyxo- and paramyxoviruses. Virology. 176 (1), 274-279 (1990).
- Banerjee, I., et al. Influenza A virus uses the aggresome processing machinery for host cell entry. Science. 346 (6208), 473-477 (2014).
- Huotari, J., et al. Cullin-3 regulates late endosome maturation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (3), 823-828 (2012).
- Yamauchi, Y., et al. Histone Deacetylase 8 Is Required for Centrosome Cohesion and Influenza A Virus Entry. PLoS Pathog. 7 (10), e1002316 (2011).
- Bachmayer, H. Selective Solubilization of Hemagglutinin and Neuraminidase from Influenza Viruses. Intervirology. 5 (5), 260-272 (1975).
- Reginster, M., Nermut, M. V. Preparation and Characterization of Influenza Virus Cores. Journal of General Virology. 31 (2), 211-220 (1976).
- Nermut, M. V. Further Investigation on the Fine Structure of Influenza Virus. Journal of General Virology. 17 (3), 317-331 (1972).
- Schulze, I. T. The structure of influenza virus: II. A model based on the morphology and composition of subviral particles. Virology. 47 (1), 181-196 (1972).
- Candiano, G., et al. Blue silver: A very sensitive colloidal Coomassie G-250 staining for proteome analysis. Electrophoresis. 25 (9), 1327-1333 (2004).
- Greber, U. F., Singh, I., Helenius, A. Mechanisms of virus uncoating. Trends in microbiology. 2 (2), 52-56 (1994).
- Yamauchi, Y., Helenius, A. Virus entry at a glance. Journal of Cell Science. 126 (6), 1289-1295 (2013).
- Zhirnov, O. P., Grigoriev, V. B. Disassembly of Influenza C Viruses, Distinct from That of Influenza A and B Viruses Requires Neutral-Alkaline pH. Virology. 200 (1), 284-291 (1994).
