In Vitro Demontering av influensa A virus kapsider ved gradientsentrifugering

Summary

Disassembly of influenza A virus cores during virus entry into host cells is a multistep process. We describe an in vitro method to analyze the early stages of viral uncoating. In this approach, velocity gradient centrifugation is used to biochemically dissect the steps that initiate uncoating under defined conditions.

Abstract

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus (IAV), virus fusion with the endosomal membrane as well as the subsequent disassembly of the viral capsid, called uncoating, is governed by the ionic conditions inside endocytic vesicles. The early steps in the virus life cycle are hard to study because endosomes cannot be directly accessed experimentally, creating the need for an in vitro approach. Here, we describe a method based on velocity gradient centrifugation of purified virions through a two-layer glycerol gradient, which enables analysis of the IAV core and its stability. The gradient contains a non-ionic detergent (NP-40) in its lower layer to remove the viral membrane by solubilization as the virus sediments toward the bottom. At neutral pH, viral cores are pelleted as stable structures. The major core components, matrix protein (M1) and the viral ribonucleoproteins (vRNPs), can be clearly identified in the pellet fraction by SDS-PAGE. Decreasing the pH to 6.0 or lower in the bottom layer selectively removes M1 from the pellet followed by release of vRNPs at more acidic conditions. Viral protein bands on Coomassie-stained gels can be subjected to densitometric quantification to monitor intermediate states of IAV disassembly. Besides pH, other factors that influence viral core stability can be assessed, such as salt concentration and putative viral uncoating factors, simply by modifying the detergent-containing glycerol layer accordingly. Taken together, the presented technique allows highly reproducible and quantitative analysis of viral uncoating in vitro. It can be applied to other enveloped viruses that undergo complex uncoating processes.

Introduction

Influensa A-virus (IAV) er en omhyllet virus og tilhører familien av Orthomyxoviridae. Dens gener er kodet på en segmentert, negativ-sense og enkelt-trådet RNA-genom. Hos mennesker fører IAV luftveisinfeksjoner, som oppstår i sesong epidemiske utbrudd og bærer potensialet for globale pandemier ^1. Ved binding til sialsyreresiduer på vertscelleoverflaten ^2, er IAV internalisert av clathrin-avhengig endocytose og klatrin-uavhengige veier ^3-8. Den sure miljø (pH <5,5) i de endocytiske vakuoler utløser en større konformasjonsendring i IAV pigg glykoprotein hemagglutinin (HA), noe som resulterer i sammensmelting av det virale og slutten av det endosomale membran ^9. Når IAV kapsid (her også referert til som viral "kjerne") har unnsluppet fra sen endosomer (LES), blir den ubelagte i cytosol, etterfulgt av transport av de virale ribonucleoproteins (vRNPs) inn i kjernen – o områdetf virusreplikasjon og transkripsjon ^10-13. Før syreaktivering av HA viruset opplever en gradvis reduksjon i pH-verdien i den endocytiske systemet, som klargjør kjerne for den etterfølgende demontering ^14-16. I denne "priming" step M2 ionekanaler i viral membranen megle tilstrømningen av protoner og K ^+10,14,16. Endringen i ionekonsentrasjonen i viruset indre forstyrrer interaksjoner bygges opp av det virale proteinet matrise M1 og de ​​åtte vRNP bunten, og letter IAV avkapsling i cytoplasma følgende membranfusjon ^10,14-17.

Direkte og kvantitativ analyse av grunningstrinn er blitt hemmet av det faktum at endosomer er vanskelig å få tilgang eksperimentelt. Oppføringen prosessen er dessuten svært ikke-synkrone. I tillegg trenger end-point-analyser, slik som QRT-PCR av frigjorte virale RNA eller infektivitet målinger, ikke gir et detaljert bilde om det biokjemiske tilstand av viral capsid på et gitt trinn av oppføring. Mens forstyrrelse av endosomes av siRNA eller medikamentell behandling har i betydelig grad bidratt til forståelsen av IAV oppføring ^18-20, finjustering er vanskelig og utsatt for uspesifikke bivirkninger i kontrollert endosomet modning program.

For å unngå disse problemene, har vi tilpasset en tidligere utviklet in vitro protokoll basert på bruk av hastighetsgradienten sentrifugering ^17. I motsetning til andre forsøk ^{21,22, 23,24,} som var for det meste basert på kombinasjoner av proteolytisk spaltning og vaskemiddel behandling etterfulgt av EM-analyse, denne tilnærmingen mellom en lett målbar resultat. Sentrifugering gjennom forskjellige graderte lag gjør at sedimenterende partikler å bli utsatt for og reagerer med endrede forhold i en kontrollert måte. I den fremlagte protokoll, IAV avledet fra klaret allantoinvæske eller rensede virale partikler sedimenteres i en to-lags glycerolgradient hvor bunnlaget inneholder det ikke-ioniske vaskemiddel NP-40 (figur 1). Som viruset kommer inn i andre, vaskemiddel inneholdende lag, blir de virale kappe lipid og konvolutt glykoproteiner forsiktig oppløst og etterlot seg. Kjernen, som består av de åtte vRNP bunt og omgitt av en matrise lag, sedimenter som en stabil struktur inn i pellet fraksjonen. Virale kjerneproteiner, slik som M1 og vRNP-assosiert nukleoprotein (NP), kan identifiseres i pellet ved hjelp av SDS-PAGE og Coomassie-farging. Spesielt å utnytte kommersielt tilgjengelige gradient gels og farging med den svært følsomme kolloidalt Coomassie ^25, gir høy presisjon og påvisning av selv små mengder viruskjerne-assosierte proteiner.

Dette setter grunnlaget for å teste om ulike forhold som pH, saltkonsentrasjon, og antatte avkapsling faktorer har effekter på sedimente oppførselen til kjernekomponenter og kjernen stabil ligheten. For å oppnå dette målet, er bare den nedre, vaskemiddel inneholdende lag i glycerol gradienten modifisert ved innføring av faktor eller tilstanden av interesse. Teknikken har vært spesielt verdifullt i å undersøke virkningen av forskjellige pH-verdier og saltkonsentrasjoner på integriteten til IAV kjerne ^16. Mellomliggende trinn av IAV avkapsling kan bli overvåket inkluderer dissosiasjon av matrikslaget i svakt surt pH (<6,5) etterfulgt av vRNP dissosiasjon ved pH 5,5 og lavere ^16,17 (figur 1). Det sistnevnte trinn ble ytterligere forbedret ved nærværet av høye K ⁺ konsentrasjon i glycerol lag, noe som reflekterer en sen endocytiske miljø ^16. Således, som viruset og kjernen sedimentert gjennom graderingen de opplevde en endring miljø som etterligner forholdene i endosomer. Resultatet var en trinnvis demontering av viral kjerne in vitro, sammenfallende resultater avledet fra cellebiologi analyser.

t "> Metoden som presenteres her har gjort det mulig rask og reproduserbar analyse av IAV (X31 og A / WSN / 33) og IBV (B / Lee / 40) avkapsling utløst av sur pH og økende K ^+16,17 samt demontering av paramyksovirus kjerner ved alkalisk pH eksponering ^17. det kan tenkes at tilnærmingen kan tilpasses andre kappekledde virus å få innsikt i de biokjemiske egenskaper av viral capsidstruktur og kapsid demontering under celle oppføring.

Protocol

1. Utarbeidelse av buffere og arkivløsninger Forbered MNT buffer (20 mM MES, 30 mM Tris og 100 mM NaCl) ved oppløsning av 470 mg Tris hydroklorid, 390 mg MES hydrat og 580 mg NaCl i 80 ml ​​DDH 2 O. Juster buffer til pH 7,4 og bringe den til et sluttvolum på 100 ml med DDH 2 O. Fremstille tre identiske oppløsninger av 500 mM MES-buffer ved å oppløse 9,76 g MES-hydrat i 80 ml ​​dH 2 O hver. Juster buffere i pH 5,8, 5,4 og 5,0 henholdsvis, ved å titrere …

Representative Results

Som allerede diskutert, grunning i endosomer er nødvendig for å gjengi IAV kjernen avkapsling kompetent. Protonering av kjernen svekker interaksjonen mellom M1 og vRNPs (sammensatt av det virale RNA, NP, og den polymerasekompleks PB1 / PB2 / PA). Denne prosessen blir initiert når innkommende virus utsettes for en pH-verdi på 6,5 (eller lavere) i tidlige endosomer (EES) og fortsetter inntil smelter viruset ved omkring pH 5,0 i LES. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-p…

Discussion

Viral capsids er metastabile makromolekylære komplekser. Selv om montering av virioner krever innkapsling og kondensasjon av virusgenomet, initiering av den neste runde av infeksjon avhenger demontering av denne kompakte kapsid struktur. Virus har utviklet seg til å utnytte ulike cellulære mekanismer for kontroll av belegget-avkapsling syklus, inkludert cellulære reseptorer, anstand, proteolytiske enzymer, fysiske krefter som tilbys av motor proteiner eller heli samt pH og ioniske brytere ^26,27. Her beskr…

Materials

cOmplete™, EDTA-free protease inhibitor tablets	Sigma-Aldrich	11873580001	The stock solution can be stored at 2 to 8 °C for 1 to 2 weeks
Glacial acetic acid	Merck Millipore	100063
Glycerol anhydrous BioChemica	AppliChem	A1123
Hydrochloric acid	Merck Millipore	100317
Long injection needle (21 GA, 9 cm, bevel or blunt-end)
MES hydrate	Sigma-Aldrich	M8250
Methanol	Merck Millipore	106009
NP-40	Sigma-Aldrich	I8896	Now commercially available as IGEPAL® CA-630
NuPAGE® 4-12% Bis-Tris mini gels, 10 wells, 1.0 mm	Life Technologies	NP0321
NuPAGE® LDS sample buffer (4X)	Life Technologies	NP0008
NuPAGE® MOPS SDS running buffer (20X)	Life Technologies	NP0001
pH indicator strips, pH 4.0 – 7.0	Merck Millipore	109542
QC Colloidal Coomassie Stain	BIO RAD	1610803
Sodium chloride	Merck Millipore	106406
Sodiumhydroxide	Merck Millipore	106498
Steritop™ filter unit	Merck Millipore	SCGPT05RE
SW41 Ti, ultracentrifuge rotor set	Beckman Coulter	331336
Thinwall, Ultra-clear centrifuge tubes, 13.2 ml, 14 x 89 mm	Beckman Coulter	344059
Tris hydrochloride	AppliChem	A1087
X31 Influenza A virus (H3N2), egg-grown, clarified allantoic fluid	Virapur		Freshly thawed on 4°C