El método aquí descrito permite realizar un análisis cronológico del desarrollo de órganos en embriones de pez cebra mediante el uso de un microscopio de fluorescencia de disección capaces de realizar seccionamiento óptico y estrategias simples de reajuste para corregir la deriva focal y plana.
Con el fin de entender la organogénesis, las alteraciones espaciales y temporales que se producen durante el desarrollo de los tejidos necesitan ser grabada. El método aquí descrito permite realizar un análisis cronológico del desarrollo normal y alteración renal en embriones de pez cebra mediante el uso de un microscopio de fluorescencia equipado para la disección de iluminación estructurada y la adquisición z-pila. Para visualizar nefrogénesis, el pez cebra transgénico (Tg (wt1b: GFP)) se utilizaron estructuras renales con la etiqueta fluorescente. Defectos renales han sido provocadas por la inyección de un oligonucleótido antisentido morfolino contra el gen del tumor de Wilms wt1a, un factor conocido por ser crucial para el desarrollo del riñón.
La ventaja de la configuración experimental es la combinación de un microscopio zoom con estrategias simples para los movimientos de re-ajuste en x, y o z dirección sin equipo adicional. Para evitar la deriva focal que es inducida por las variaciones de temperatura y vibraciones mecánicas, Una estrategia de enfoque automático se aplicó en lugar de utilizar una cámara ambiental por lo general es necesario. Con el fin de volver a ajustar los cambios de posición debido a la xy la deriva, se emplearon cámaras de imagen con rejillas de reubicación inducida.
En comparación con las configuraciones más complejas para el registro cronológico de seccionamiento óptico como el escaneo láser confocal o microscopios de lámina de luz, un microscopio zoom es fácil de manejar. Además, ofrece la disección de beneficios-microscopio específico, tales como alta profundidad de campo y una distancia de trabajo prolongado.
El método para estudiar la organogénesis presentado aquí también se puede utilizar con los microscopios de fluorescencia estéreo no capaces de seccionamiento óptico. Aunque limitada para alto rendimiento, esta técnica ofrece una alternativa a los equipos más complejos que normalmente se utiliza para la grabación de lapso de tiempo de los tejidos en desarrollo y la dinámica de órganos.
Después de la gastrulación, la organogénesis es la siguiente etapa del ciclo de vida de un individuo. Se trata de la transposición, la interacción y muy a menudo la migración de las células para producir tejidos y órganos. La inexactitud en los procesos que subyacen al desarrollo de órganos a menudo conduce a enfermedades que pueden manifestarse de forma inmediata o también más tarde en la vida. Por lo tanto, la comprensión de la organogénesis ha realizado un esfuerzo importante en la biología del desarrollo y la investigación biomédica. Con el fin de ser capaz de investigar el desarrollo de un órgano en particular, tiene que ser visible incluso a través de la pared del cuerpo del embrión. Esto permite la grabación de las alteraciones espaciales y temporales que se producen durante el desarrollo. También con el fin de analizar la importancia de los factores involucrados en la organogénesis, que tiene que ser susceptible a la manipulación.
Un organismo que es muy adecuado para la investigación de la organogénesis in vivo es el pez cebra. su transparencia durante el desarrollo embrionario en combinación con el uso de líneas transgénicas fluorescentes permite la observación de la dinámica de localización de proteínas y de expresión, así como la visualización de los órganos internos 1. Esto proporciona una ventaja única sobre la investigación del desarrollo de órganos en tiempo real en comparación con los modelos de mamíferos cuyos órganos son inaccesibles para el análisis microscópico. Por otra parte, diferentes herramientas están disponibles para manipular el desarrollo embrionario del pez cebra. Además de la generación de líneas mutantes, los oligonucleótidos antisentido de morfolino (MO) se pueden utilizar para derribar la actividad de genes particulares que están implicados en el desarrollo de ciertos órganos. OM o bien se dirigen a un sitio de empalme o el codón de iniciación de la traducción (AUG), y por lo tanto interfieren con la unión de pre-mRNA o la traducción.
El riñón embrionario del pez cebra, el pronefros, es un modelo anatómico sencillo pero muy valioso para estudiar el desarrollo del riñón y la función del genes relacionados con enfermedades renales 2. Se compone de sólo dos unidades funcionales, llamadas nefronas. Cada nefrona consta de un glomérulo, donde la filtración de la sangre se lleva a cabo 3. Otros componentes son la región del cuello corto, así como el túbulo segmentado para la secreción y reabsorción de solutos y el conducto, que termina en la cloaca 4. Independientemente de su composición simple, la organización y los diferentes tipos de células de los pronefros de pez cebra son muy similares a la de riñón de mamífero 5,6.
Un factor, que es críticamente implicado en el desarrollo del riñón, es codificada por el gen del tumor de Wilms supresor Wt1 7. El pez cebra posee dos paralogs llamados wt1a y wt1b se expresa en un patrón idéntico de solapamiento, pero no durante el desarrollo de los pronefros 8. Mediante el uso de pez cebra transgénico con estructuras pronefros GFP-etiquetados, se ha demostrado que completa knock-down de wt1a </ em> o de un empalme forma particular, conduce a malformaciones graves o leves de riñón embrionario 9,10, respectivamente.
El método aquí descrito permite realizar un análisis cronológico de nefrogénesis normal y alterada en embriones de pez cebra mediante el empleo de un microscopio de fluorescencia equipado para la disección de la sección óptica a través de la iluminación estructurada. secciones ópticas en general permiten la adquisición de imágenes que sólo contienen información de enfoque. Fuera de la información de enfoque se puede evitar mediante diversos enfoques tales como algoritmos matemáticos (por ejemplo. Deconvolución), diseño óptico (por ejemplo, láser confocal de microscopía de barrido) o una combinación de ambos (por ejemplo, la iluminación estructurada).
Para inducir defectos en el desarrollo del riñón se utilizó un antisentido contra MO wt1a que se inyectó en una línea de pez cebra transgénico (Tg (wt1b: GFP)). Esta línea muestra la fluorescencia de GFP-en el glomérulo, el cuello y la parte anteriorparte del túbulo 9,10. En comparación con las configuraciones más complejas para las grabaciones con lapso de tiempo con seccionamiento óptico como el escaneo láser o microscopios de lámina de luz, un microscopio zoom es fácil de manejar y menos costoso. Por otra parte, el equipo para la iluminación estructurada fácilmente se puede combinar con el equipo convencional de fluorescencia (por ejemplo, la fluorescencia de la lámpara, los filtros) y ofrece ventajas de disección-microscopio específico, como una distancia de trabajo extendida y gran campo de visión. Problemas con la deriva se resolvieron sin necesidad de utilizar equipos adicionales (cámara ambiental, mesa antivibraciones) normalmente requerido para obtener resultados estables. Para corregir la deriva de coordinación se estableció una estrategia de enfoque automático y se utilizaron cámaras de imagen con rejillas de reubicación impresos para volver a ajustar el posicionamiento después de una desviación en dirección xo y.
El método presentado también se puede aplicar a los microscopios sin opciones seccionamiento óptico, tales como estéreo fluorescencia microscopes y ofrece una alternativa a los equipos más complejos que normalmente se utiliza para la grabación de lapso de tiempo de los tejidos en desarrollo y la dinámica de órganos.
El pez cebra se ha convertido en un organismo modelo popular para los estudios de desarrollo de los vertebrados y modelos de enfermedades humanas. Debido a embriones de pez cebra permanecen transparentes, los órganos en desarrollo como el cerebro y el corazón se pueden observar con un microscopio preparación estándar. Aprovechando las líneas transgénicas con fluorescencia específica de órganos permite la evaluación de la organogénesis a lo largo de las diferentes etapas de desarrollo en embriones vivos por microscopía de fluorescencia. Una limitación para obtener imágenes de los detalles estructurales de órganos enteros con microscopía de epifluorescencia estándar es el impacto de las señales de los objetos encima y por debajo del plano focal. Esta luz fuera de foco no sólo resulta en la disminución de contraste de imagen y resolución, sino que también puede oscurecer las estructuras importantes de interés 13,14. Varias técnicas tales como confocal- de escaneo láser, hilatura confocal- disco o microscopía multifotónica se han desarrollado para reducir al mínimo la información fuera de foco y de este modo Increase contraste de la imagen así como la resolución axial. Un método alternativo para obtener secciones ópticas es la microscopía libre estructurado iluminación láser y escáner, una basada en el amplio campo técnica de iluminación que es fácil de implementar y en un microscopio normal 15. Los resultados presentados aquí muestran que la sección óptica, alcanzado por la iluminación estructurada, implementado en un microscopio de disección y se combina con la reconstrucción de imágenes de enfoque extendidas, permite la visualización de detalles estructurales de normal y perturbado el desarrollo del riñón en el pez cebra. En particular, las células positivas para GFP en morphants wt1a se dispersan a diferentes profundidades focales, y las imágenes de un solo plano con la falta de definición foco fuera de la red sería subestimar la complejidad de tres dimensiones del fenotipo.
Para seguir la dinámica del órgano organización, reorganización o la interrupción, la microscopía de fluorescencia de lapso de tiempo es un potente aunque compleja técnica. Durante lapso de tiempode imágenes ligeras vibraciones o cambios de temperatura menores causan derivas en x, y o z. Esto exige equipo adicional (cámara ambiental, mesa de anti-vibración) con el fin de obtener resultados estables. El método presentado utiliza la capacidad de un microscopio de disección con una unidad de enfoque motorizado para grabar imágenes con lapso de tiempo sin dispositivos adicionales. Para mantener un enfoque estable, se estableció una estrategia de enfoque automático y una rejilla reubicación impreso en la parte inferior de la cámara de formación de imágenes se utiliza para la corrección de x, la inestabilidad y-.
incrustación adecuada del embrión es un paso crítico en el protocolo. Se necesita algo de práctica para colocar la estructura de interés lo más cerca posible a la parte inferior de vidrio y en estrecha proximidad a la red sin superposición con él.
La principal ventaja del método es que es una herramienta asequible y simple para la observación directa de los procesos de desarrollo tales como el crecimiento y la migración en la vidaembriones durante varias horas. Por otra parte, los beneficios-microscopio de disección específica como gran campo de visión y la distancia de trabajo extendida facilitar el examen de las muestras más grandes, incluyendo órganos enteros. Sin embargo, algunas limitaciones tienen que ser tenidos en cuenta. La pausa del experimento para comprobar y reajustar el posicionamiento hace que el procedimiento requiere mucho tiempo y la ausencia de un control de la temperatura robusta cambia el tiempo de desarrollo "estándar", que se define como post hr fertilización a 28,5 ° C para el pez cebra 16. Otro problema potencial es la profundidad limitada de formación de imágenes en el animal, en particular cuando la estructura de interés se encuentra dentro del embrión o larva. Tal estructura es el glomérulo pronephric pez cebra, que está situado entre los somitas y el saco vitelino. Se encontró que la profundidad límite para obtener imágenes de los glomérulos en alrededor de 200 micras, una distancia que se alcanza después de 5 días de desarrollo. En contraste, las estructuras fluorescentes que son lbicada más cerca de la superficie del animal puede ser reflejado por un tiempo más largo. Por ejemplo las células del hígado son accesibles para la formación de imágenes por lo menos hasta 9 dpf. Una limitación adicional es que la inmovilización a largo plazo del embrión o larva en agarosa y tratamiento tricaína inducir el retraso del crecimiento y el edema cardiaco, respectivamente. Debido a que esto puede interferir con el desarrollo normal, se recomienda limitar la duración de la grabación de lapso de tiempo para un cierto periodo de interés. Para asegurar que durante las estructuras de formación de imágenes de interés se desarrolla normalmente es útil para comparar (al final) la apariencia general con la de un animal mantuvo en las mismas condiciones experimentales, pero sin incorporar y anestesia.
Grabación de un z-pila de secciones ópticas cada 30 minutos durante un período de 5 horas y el posterior cálculo de la profundidad de foco imágenes a cabo siempre la información espacial y temporal sobre los primeros eventos de la normal y perturba el desarrollo del riñón que fue inducida bdesmontables de wt1a y morfolino-mediada. Experimentos morpholino desmontables realizados anteriormente ya han demostrado que Wt1a cumple un papel temprano y esencial en la formación de pronefros La hibridación in situ con marcador renal 17,18 y el empleo de la wt1b transgénico:. GFP línea para el desarrollo pronefros de imagen a tiempo fijo 9,10 puntos revelado que la deficiencia en la morfogénesis wt1a glomerular perturbado y fallaron especificación de podocitos. En contraste con estos enfoques estáticos, grabaciones con lapso de tiempo visualizar directamente la dinámica de nefrogénesis temprano en embriones de control y la migración de las células GFP-positivas fuera de la región pronephric en morphants wt1a. La posibilidad de realizar un seguimiento de las células mal encaminadas en el tiempo permite un análisis más detallado fenotipo.
En general, el método que se presenta aquí proporciona un barato y fácil de usar alternativa al complejo, y menos accesibles setups normalmente utilizados para la imagen de lapso de tiempo, tales como el microscopio de barrido láser (equipado con una cámara ambiental y mesa antivibraciones) o un microscopio de lámina de luz. La rutina descrita para solucionar los problemas de deriva también puede ser aplicado para realizar imágenes con lapso de tiempo en configuraciones sin opciones seccionamiento óptico, tales como microscopios de fluorescencia estéreo.
La técnica no sólo es adecuado para investigar el desarrollo del riñón, pero también se puede aplicar para controlar la morfogénesis normal y defectuoso de otros órganos tales como el corazón o el hígado. Además, el método se puede utilizar para observar varios procesos más dinámicos en organismos modelo embrionarias y adultas, tales como la curación o regeneración de heridas.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a Thomas Bates para la lectura crítica y mejorar el manuscrito. Agradecemos también a Christina Ebert y Sabrina Stötzer para el mantenimiento de los peces.
Material | |||
Control Morpholino | Gene tools, LLC | Standard control oligo | Prepared control oligo |
wt1a Morpholinos | Gene tools, LLC | customized | Designted to target the first splice donor site, sequence as published in Ref. Nr. 9 |
0,5% Phenol red solution | Sigma | P0290 | Injection tracer |
peqGOLD universal agarose | peqlab | 35-1020 | To prepare microinjection dish |
Glass capillaries (GC100F-10) | Hugo Sachs Elektronik | 30-0019 | To generate injection needles |
Microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | To load the microinjection needle |
Dumont forceps | Fine Sience Tools | 91150-20 | To generate an opening at the needle tip |
Embryo water (0.3x Danieaus´ solution) | 1x: 58 mM NaCl, 0.7 mM KCl, 0.4 mM MgSO4, 0.6 Ca(NO3)2, 5 mM HEPES, pH: 7,5; Do not add methylene blue! | ||
Graticule 5mm / 0.05mm | Science Services | PY68039-02 | For calculation of injection amount |
Pasteur pipette 137 mm, 4.8 ml | Roth | E305.1 | To collect eggs, to transfer embryos and to remove dead embryos |
Pasteur pipette with ultra-thin tip 157 mm, 3.5 ml | Roth | E304.1 | To remove excess of water |
N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma | P7629 | For suppression of melanization |
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma | E10521 | To anethesize zebrafish |
Low melting agarose | Biozym | 850111 | For embedding |
µ-dish 35 mm, high Glass Bottom Grid-50 | ibidi | 81148 | Imaging chamber |
Gel loader tips | Hartenstein | GS05 | To orient the embryo for proper embedding |
Equipment | |||
Micropipette puller (model P-97) | Sutter Instrument | To generate injection needles | |
Micromanipulator | Saur Laborbedarf | For microinjection | |
Thermomixer copact | Eppendorf | Thermoblock for tempering the low melting agarose | |
SZ61 (Stereomicroscope) | Olympus | For injection control | |
Axio Zoom. V16 | Zeiss | For embedding and imaging | |
ApoTome.2 slider | Zeiss | For optical sectioning | |
AxioCam MRm | Zeiss | For image acquisition | |
ZEN 2012 | Zeiss | Imaging software |