Identificación de MyoD Interactome Usando Tandem Affinity purificación Acoplada a la Espectrometría de Masas
Summary
MyoD is a myogenic transcription factor with a strong capacity to induce myogenic transdifferentiation of many fully differentiated non-muscle cell lines. The epigenetic mechanisms involved in this transdifferentiation are largely unknown. Here we describe a double-affinity purification method followed by mass spectrometry to exhaustively characterize MyoD partners.
Abstract
Esquelética diferenciación terminal muscular comienza con el compromiso de las células precursoras mesodérmicas pluripotentes de mioblastos. Estas células tienen todavía la capacidad de proliferar o pueden diferenciar y fusible en miotubos multinucleados, que maduran adicionalmente para formar miofibras. Esquelético muscular diferenciación terminal está orquestada por la acción coordinada de diversos factores de transcripción, en particular los miembros de los factores o MFR reguladoras musculares (MyoD, Miogenina, Myf5 y MRF4), también llamado el bHLH myogenic factores de transcripción de la familia. Estos factores cooperan con los complejos de remodelación de la cromatina dentro elaborada red de regulación transcripcional para lograr la miogénesis esquelético. En esto, MyoD se considera el factor de transcripción miogénica principal en el desencadenamiento de la diferenciación terminal muscular. Esta noción se ve reforzada por la capacidad de MyoD para convertir células no musculares en las células del músculo esquelético. Aquí se describe un enfoque utilizado para identificar MyoDcompañeros de la proteína de una manera exhaustiva con el fin de dilucidar los diferentes factores que intervienen en la diferenciación terminal del esqueleto muscular. El objetivo a largo plazo es entender los mecanismos epigenéticos implicados en la regulación de los genes del músculo esquelético, es decir, las metas. MyoD. socios MyoD se identifican mediante el uso de Tandem Purificación por Afinidad (TAP-Tag) de un sistema heterólogo acoplado a la caracterización Espectrometría de Masas (MS), seguido de la validación del papel de los interlocutores relevantes durante la diferenciación terminal del esqueleto muscular. formas aberrantes de factores miogénicos, o su regulación aberrante, se asocian con una serie de trastornos musculares: miastenia congénita, distrofia miotónica, rabdomiosarcoma y defectos en la regeneración muscular. Como tal, factores miogénicos proporcionan un número de posibles dianas terapéuticas en trastornos musculares, tanto con respecto a los mecanismos que causan la enfermedad en sí y los mecanismos de regeneración que puede mejorar el tratamiento de la enfermedad. Por lo tanto, la understan detalladading de las interacciones intermoleculares y los programas genéticos controlados por los factores miogénicos es esencial para el diseño racional de terapias eficaces.
Introduction
organismos multicelulares eucariotas están compuestos de diferentes órganos y tejidos. Cada tejido funcional tiene una expresión patrón de gen específico, que se determina en cada paso diferenciación. La diferenciación celular implica la activación de genes específicos, el mantenimiento de su expresión y, en general, el silenciamiento de un conjunto de genes, tales los que participan en la proliferación celular. la diferenciación del músculo esquelético, o miogénesis, es por tanto un proceso de múltiples pasos, que comienza con la determinación de las células madre mesodérmicas en mioblastos, y luego lleva a la diferenciación terminal de estas mioblastos en primera mono-nucleado, y a continuación, multi-nucleado, miotubos . Por lo tanto, los mioblastos se "determinan" las células, que son todavía capaces de proliferar, pero que están comprometidos con el linaje del músculo esquelético, y por lo tanto pueden diferenciar únicamente en las células del músculo esquelético, ya sea durante el desarrollo embrionario o en la regeneración del músculo adulto. El proceso de la terminal de músculo esquelético difierendife- está orquestada por un programa genético específico que comienza con la salida permanente del ciclo celular de las células precursoras de mioblastos que conduce a un silenciamiento definitiva de la proliferación asociada genes, tales como E2F genes diana 1. De hecho, durante el proceso de diferenciación terminal, detener la proliferación de mioblastos es un paso crucial que precede a la expresión de genes específicos del músculo esquelético y la fusión de mioblastos en miotubos 2. un programa de este tipo permite células madre musculares adultas, también llamadas células satélite, para diferenciar durante el proceso de regeneración tras una lesión del músculo esquelético.
Miogénesis mamífero es críticamente dependiente de una familia de miogénica hélice-bucle-hélice (bHLH) factores de transcripción MyoD, Myf5, MRF4 y Miogenina, a menudo referido como la familia de factores de determinación del esqueleto muscular o MFR (músculo factores reguladores) 3. Cada uno de ellos tiene un papel esencial en la especificación y difdiferencia- de las células del músculo esquelético y tiene un patrón de expresión específico 4 5-7. La activación de Myf5 y MyoD constituye el paso determinante que compromete a las células con el linaje miogénico, y la posterior expresión de miogenina desencadena la miogénesis con la activación de genes específicos de músculo esquelético, como MCK (Muscle creatina quinasa). Myogenic factores de transcripción bHLH cooperan con miembros de la familia MEF2 en la activación de genes musculares de loci previamente silenciosa 8. También estimulan la transcripción de genes del esqueleto muscular como heterodímeros con proteínas bHLH ubicua, E12 y E47, conocidas como proteínas E, que se unen las denominadas cajas E en varias regiones gen regulador de las 8. Twist, Id (inhibidor de la diferenciación) y otros factores regulan negativamente este proceso, al competir con MyoD de proteínas E de unión 8.
MyoD es considerado como el principal jugador en el desencadenamiento de la diferenciación terminal muscular 9 </shasta> ya que tiene la capacidad de inducir un programa de determinación miogénica / diferenciación (trans-diferenciación) en muchos sistemas no musculares completamente diferenciadas 10-13. De hecho, la expresión forzada de MyoD induce la trans-diferenciación de los distintos tipos celulares, incluso las derivadas de otro origen embriológico 12. Por ejemplo, puede convertir MyoD hepatocitos, fibroblastos, melanocitos, los neuroblastos, y adipocitos en células musculares similares. La acción trans-diferenciación de MyoD implica una activación anormal del programa genético miogénica (en particular sus genes diana) en un entorno no-muscular, concomitante con el silenciamiento del programa genético original (en particular, la proliferación de genes).
En la proliferación de mioblastos, MyoD se expresa pero es incapaz de activar sus genes diana incluso cuando se une a sus promotores 14-16. Por lo tanto, el requisito de MyoD a ser expresadas de forma continua en mioblastos indiferenciados sigue siendo bastante elusiva. MyoD pudo reprimir sus genes diana debido a la contratación de las enzimas represivas cromatina modificadores en la proliferación de mioblastos antes de la carga de la activación de las enzimas de remodelación de la cromatina 14,17. Por ejemplo, en la proliferación de mioblastos, MyoD se asocia con co-represor transcripcional CAP-1, las histona desacetilasas (HDACs) y methyltransferases lisina represivos (KMTS), incluyendo la lisina de la histona H3 9 o H3K9 y H3K27 KMTS, y suprimir de forma activa su expresión genes diana mediante el establecimiento de un local represiva 14,17 estructura de la cromatina. Es importante destacar que un informe reciente indica que MyoD resulte directa metilado H3K9 por el KMT G9a lo que resulta en la inhibición de su actividad transactivadora 16.
Los mecanismos epigenéticos que participan en este trans-diferenciación de las células no musculares por MyoD son en gran parte desconocidos. En particular, algunas líneas de células son resistentes a la MyoD inducida trans-diferenciación. Por lo tanto, en células HeLa, MyoD es o bien inactiva oincluso podría funcionar como represor en lugar de activador de la transcripción debido a la falta de expresión de la subunidad BAF60C de la remodelación de la cromatina complejo SWI / SNF 18. Este modelo puede por lo tanto ser de elección para caracterizar mejor los mecanismos de la represión de genes MyoD inducida. También es adecuado para ensayar la capacidad de MyoD para inducir la cromatina medio ambiente represivo en su meta loci asociados con sus socios y por lo tanto descubrir los mecanismos represivos MyoD-dependiente en la proliferación de mioblastos para afinar la diferenciación terminal.
A continuación se describe el protocolo para la identificación de los socios MyoD utilizando Tandem Purificación por Afinidad (TAP-Tag) acoplada a espectrometría de masas caracterización (MS). El uso de células HeLa-S3 que expresan de forma estable Bandera-HA-MyoD permitido obtener suficiente material para purificar los complejos de MyoD a partir de extractos nucleares fraccionadas. La identificación de los socios MyoD en el sistema heterólogo fue seguido por validatien un sistema en cuestión.
Protocol
Representative Results
Discussion
El método presentado permite la identificación exhaustiva de los socios de un factor de transcripción, MyoD. Se reveló socios MyoD en un sistema heterólogo resistente a la diferenciación inducida por MyoD, es decir, células HeLa-S3. Por lo tanto, por definición, los socios de MyoD identificados se expresan de forma ubicua. Estos incluyen factores generales y específicos de la secuencia de transcripción, enzimas de la cromatina modificadores de proteínas, procesamiento del ARN, quinasas (Tablas 1</stro…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Work in the Ait-Si-Ali lab was supported by the Association Française contre les Myopathies Téléthon (AFM-Téléthon); Institut National du Cancer (INCa); Agence Nationale de la Recherche (ANR), Fondation Association pour la Recherche sur le Cancer (Fondation ARC); Groupement des Entreprises Françaises pour la Lutte contre le Cancer (GEFLUC); CNRS; Université Paris Diderot and the ”Who Am I?” Laboratory of Excellence #ANR-11- LABX-0071 funded by the French Government through its ”Investments for the Future” program operated by the ANR under grant #ANR-11-IDEX-0005-01. EB was supported by an INCa grant.
Materials
| Cell lines | |||
| HeLa-S3 | ATCC | CCL-2.2 | |
| C2C12 | ATCC | CRL-1772 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Spinner | Corning | 778531 | |
| Homogenizer : Dounce homogenizer | Wheaton | 432-1273 and 432-1271 | |
| Agitating device for spinners | Bellco | 778531 | |
| Sonicator | Diagenode | UCD 200 | |
| Hemocytometer | Marienfeld Superior | 640610 | |
| Low-binding tubes | Sorenson | 27210 | |
| Empty spin column | Bio-Rad | 7326204 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| SDS-polyacrylamide 4-12 % gel | Life technologies | NP0336BOX | |
| 4X loading buffer | Life technologies | NP0007 | |
| 10X reducing agent | Life technologies | NP0004 | |
| Silver staining kit | Life technologies | A8592 | |
| Centrifugal filter units, 10K | Millipore | UFC501024 | |
| Protein G agarose beads | Sigma-Aldrich | P4691 | |
| Protein A/G Resin | Thermo Scientific | 53132 | |
| Flag resin (anti-Flag M2-agarose affinity gel) | Sigma-Aldrich | A2220 | |
| HA resin (monoclonal Anti-HA agarose) | Sigma-Aldrich | A2095 | |
| MNase | Sigma-Aldrich | N3755 | |
| Flag free peptide (DYKDDDDK) | Ansynth Service BV | Custom synthesis | Resuspend up to 4 mg/mL in 50 mM Tris-HCl, pH 7.8 |
| HA free peptide (YPYDVPDYA) | Ansynth Service BV | Custom synthesis | Resuspend up to 4 mg/mL in 50 mM Tris-HCl, pH 7.8 |
| Bicinchoninic acid based protein assay kit : BCA kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Protease inhibitors | Sigma-Aldrich | S8830 | |
| Luminol-based enhanced chemiluminescence (ECL) HRP substrate | Life technologies | 34075 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| Sheared salmon sperm DNA (Deoxyribonucleic acid sodium salt from salmon testes) | Sigma-Aldrich | D1626 | |
| Spermine tetrahydrochloride | Sigma-Aldrich | S1141 | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | S0266 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| MOPS running buffer | Life technologies | NP0001 | |
| DMEM (high glucose) | Sigma-Aldrich | D0822 | Pre-warm at 37 °C before use |
| Trypsin-EDTA (0.05% phenol red | Life technologies | 25300-054 | |
| Serum | GE healthcare life sciences | PAA A15-102 | Each lot of serum has to be first tested for your cells. |
| Penicillin and Streptomycin | Life technologies | 15140-122 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Life technologies | 15250-061 | |
| Water (sterile-filtered) | Sigma-Aldrich | W3500 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| HA from rat (12CA5) | Roche | 11583816001 | |
| Flag | Sigma-Aldrich | A8592 | |
| MyoD | Santa Cruz | sc-32758 | To use for western blotting |
| MyoD | Santa Cruz | SC-760 | To use for immunoprecipitation and western blotting |
| CBFbeta | Santa Cruz | FL-182 | |
| HP1alpha | Euromedex | 2HP2G9 | |
| HP1beta | Euromedex | 1MOD1A9AS | |
| HP1gamma | Euromedex | 2MOD1GC | |
| Suv39h1 | Cell Signaling Technology | 8729 | |
| BAF47 | BD Biosciences | 612111 | |
| Myf5 | Santa Cruz | SC-302 | |
| Tubulin | Sigma-Aldrich | T9026 | |
| Actin | Sigma-Aldrich | A5441 | |
| IgG Mouse | Santa Cruz | SC-2025 | |
| IgG Rabbit | Santa Cruz | SC-2027 | |
| Goat anti-rat -HRP | Sigma-Aldrich | A9037 | |
| Goat anti-rabbit -HRP | Sigma-Aldrich | A6154 | |
| Goat anti-mouse -HRP | Sigma-Aldrich | A4416 |
References
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