Identificazione di MyoD Interattoma Utilizzando Tandem Affinity Purification accoppiato alla spettrometria di massa
Summary
MyoD is a myogenic transcription factor with a strong capacity to induce myogenic transdifferentiation of many fully differentiated non-muscle cell lines. The epigenetic mechanisms involved in this transdifferentiation are largely unknown. Here we describe a double-affinity purification method followed by mass spectrometry to exhaustively characterize MyoD partners.
Abstract
Scheletrico differenziazione terminale muscolare inizia con l'impegno di cellule precursori mesodermiche pluripotenti a mioblasti. Queste cellule hanno ancora la capacità di proliferare o possono differenziarsi e si fondono in miotubi multinucleati, che maturare ulteriormente per formare fibre muscolari. Scheletrico differenziazione terminale muscolare è orchestrata con l'azione coordinata di diversi fattori di trascrizione, in particolare i membri dei fattori regolatori muscolari o MRF (MyoD, Myogenin, Myf5, e MRF4), chiamato anche il miogena bHLH fattori di trascrizione della famiglia. Questi fattori cooperano con i complessi della cromatina-rimodellamento all'interno della rete regolamentare trascrizionale elaborato per raggiungere miogenesi scheletrico. In questo, MyoD è considerato il maestro miogenico fattore di trascrizione nello scatenare differenziamento terminale muscolare. Questa nozione è rafforzata dalla capacità di MyoD convertire cellule non muscolari in cellule muscolari scheletriche. Qui si descrive un metodo utilizzato per identificare MyoDpartner proteici in modo esaustivo, al fine di chiarire i diversi fattori coinvolti nella scheletrico differenziazione terminale muscolare. L'obiettivo a lungo termine è quello di comprendere i meccanismi epigenetici coinvolti nella regolazione dei geni muscolo scheletrico, vale a dire., Obiettivi MyoD. partner MyoD sono identificati utilizzando Tandem Affinity Purification (TAP-Tag) da un sistema eterologo accoppiato alla caratterizzazione spettrometria di massa (MS), seguito dalla validazione del ruolo delle parti interessate durante scheletrico differenziamento terminale muscolare. forme aberranti di fattori miogenici, o la loro regolamentazione aberranti, sono associati con una serie di disturbi muscolari: miastenia congenita, distrofia miotonica, rabdomiosarcoma e difetti nella rigenerazione muscolare. Come tale, i fattori miogenici forniscono un pool di potenziali bersagli terapeutici nei disturbi muscolari, sia per quanto riguarda i meccanismi che causano la malattia stessa e meccanismi rigenerativi che possono migliorare il trattamento della malattia. Così, il understan dettagliatading delle interazioni intermolecolari ei programmi genetici controllate dai fattori miogenici è essenziale per la progettazione razionale di terapie efficaci.
Introduction
organismi pluricellulari eucarioti sono composti da diversi organi e tessuti. Ogni tessuto funzionale ha un pattern di espressione genica specifica, che è determinato ad ogni passo differenziazione. differenziazione cellulare coinvolge l'attivazione di geni specifici, manutenzione della loro espressione e, in generale, il silenziamento di una serie di geni come quelli coinvolti nella proliferazione cellulare. Scheletrico differenziamento muscolare, o miogenesi, è quindi un processo a più fasi, che inizia con la determinazione delle cellule staminali mesodermiche in mioblasti, e poi porta alla differenziazione terminale di questi mioblasti in primo mono-nucleate, e quindi multi-nucleate, miotubi . Così, i mioblasti vengono "determinate" Le cellule, che sono ancora in grado di proliferare, ma si sono impegnati a lignaggio muscolo scheletrico, e quindi in grado di differenziarsi solo in cellule del muscolo scheletrico sia durante lo sviluppo embrionale o nella rigenerazione del muscolo adulto. Il processo di terminale muscolo scheletrico differireziazione è orchestrato da uno specifico programma genetico che inizia con l'uscita permanente dal ciclo cellulare delle cellule precursori mioblasti che conduce ad un silenziamento definitiva di proliferazione associati geni, come E2F geni target 1. Infatti, durante il processo di differenziazione terminale, arresto mioblasti proliferazione è un passo cruciale che precede l'espressione di geni specifici muscolo scheletrico e la fusione dei mioblasti in miotubi 2. Tale programma permette cellule staminali muscolari adulte, dette anche cellule satelliti, per differenziare durante il processo di rigenerazione dopo un trauma del muscolo scheletrico.
Miogenesi mammiferi è criticamente dipendente da una famiglia di miogenico elica-ansa-elica (bHLH) fattori di trascrizione MyoD, Myf5, MRF4 e Myogenin, spesso indicato come la famiglia di fattori scheletrico determinazione muscolare o MRF (muscolo fattori normativi) 3. Ciascuno di essi ha un ruolo essenziale nella specifica e differenziazione delle cellule del muscolo scheletrico e ha uno specifico modello di espressione 4 5-7. L'attivazione di Myf5 e MyoD costituisce il passo determinante che impegna le cellule al lignaggio miogenico, e la successiva espressione di Myogenin innesca miogenesi con l'attivazione di geni specifici del muscolo scheletrico, come MCK (muscolo creatina chinasi). Myogenic fattori di trascrizione bHLH collaborano con i membri della famiglia MEF2 nel attivazione di geni muscolari da loci precedentemente silenziosa 8. Essi hanno inoltre stimolare scheletrico trascrizione genica muscolare eterodimeri con le proteine onnipresente bHLH, E12 e E47, note come proteine E, che legano i cosiddetti E-box in varie regioni del gene-normativo 8. Twist, Id (inibitore di differenziazione) e di altri fattori regolano negativamente questo processo, competendo con MyoD per le proteine di legame E 8.
MyoD è considerato come il giocatore importante nello scatenare muscolare terminale differenziazione 9 </sup> poiché ha la capacità di indurre un programma determinazione miogenico / differenziazione (trans-differenziazione) in molti sistemi non-muscolari completamente differenziate 10-13. In effetti, l'espressione forzata di MyoD induce la trans-differenziazione dei diversi tipi cellulari, anche quelli derivati da un'altra origine embryologic 12. Ad esempio, MyoD in grado di convertire gli epatociti, fibroblasti, melanociti, neuroblasti, e adipociti in cellule muscolari-like. L'azione trans-differenziativo di MyoD comporta un'attivazione anomala del programma genetico miogenico (in particolare i suoi geni bersaglio) in un ambiente non-muscolare, concomitante al silenziamento del programma genetico originale (in particolare, i geni della proliferazione).
In proliferanti mioblasti, MyoD è espressa, ma non è in grado di attivare i suoi geni bersaglio anche quando si lega ai loro promotori 14-16. Pertanto, il requisito di MyoD siano continuamente espressi in mioblasti indifferenziati rimane abbastanza elusive. MyoD potrebbe reprimere i suoi geni bersaglio dovuto all'assunzione di enzimi cromatina modificanti repressive in proliferanti mioblasti prima del carico di attivare il rimodellamento della cromatina enzimi 14,17. Per esempio, in proliferanti mioblasti, MyoD è associata a trascrizionale co-repressori KAP-1, istone deacetilasi (HDAC) e metiltransferasi lisina repressive (km in linea), tra cui l'istone H3 lisina 9 o H3K9 e H3K27 km in linea, e sopprimere attivamente la sua espressione di geni bersaglio attraverso la definizione di un locale repressiva struttura della cromatina 14,17. È importante sottolineare che un recente rapporto ha indicato che MyoD è essa stessa direttamente metilato dalle H3K9 il KMT G9a con conseguente inibizione della sua attività transattivante 16.
I meccanismi epigenetici coinvolti in questa trans-differenziazione delle cellule non muscolari di MyoD sono largamente sconosciuti. In particolare, alcune linee cellulari sono resistenti a MyoD indotta trans-differenziazione. Così, in cellule HeLa, MyoD è inattivo oaddirittura potrebbe funzionare come repressore piuttosto che attivatore della trascrizione a causa della mancanza di espressione della subunità BAF60C del rimodellamento della cromatina complesso SWI / SNF 18. Questo modello può quindi essere di scelta per caratterizzare meglio i meccanismi di MyoD indotta repressione gene. E 'adatto anche per saggiare la capacità di MyoD di indurre ambiente cromatina repressiva alla sua loci bersaglio con i suoi partner associati e quindi scoprire i meccanismi repressivi MyoD-dipendente della proliferazione mioblasti per mettere a punto la differenziazione terminale.
Qui si descrive il protocollo per l'identificazione dei partner MyoD utilizzando Tandem Affinity Purification (TAP-Tag) accoppiata alla spettrometria di massa caratterizzazione (MS). L'uso di cellule HeLa-S3 esprimono stabilmente Flag-HA-MyoD consentito di ottenere abbastanza materiale per purificare i complessi MyoD da estratti nucleari frazionati. L'identificazione di partner MyoD nel sistema eterologo è seguito validation in un sistema di riferimento.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il metodo presentato consenta l'identificazione esaustivo di partner di un fattore di trascrizione, MyoD. Ha rivelato partner MyoD in un sistema eterologo resistente alla differenziazione MyoD indotta, ovvero cellule HeLa-S3. Così, per definizione, i partner MyoD identificati sono ubiquitariamente espressi. Questi includono fattori generali e specifici di sequenza di trascrizione, enzimi cromatina modificanti, proteine di elaborazione RNA, chinasi (Tabelle 1 e 2). Dato che le…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Work in the Ait-Si-Ali lab was supported by the Association Française contre les Myopathies Téléthon (AFM-Téléthon); Institut National du Cancer (INCa); Agence Nationale de la Recherche (ANR), Fondation Association pour la Recherche sur le Cancer (Fondation ARC); Groupement des Entreprises Françaises pour la Lutte contre le Cancer (GEFLUC); CNRS; Université Paris Diderot and the ”Who Am I?” Laboratory of Excellence #ANR-11- LABX-0071 funded by the French Government through its ”Investments for the Future” program operated by the ANR under grant #ANR-11-IDEX-0005-01. EB was supported by an INCa grant.
Materials
| Cell lines | |||
| HeLa-S3 | ATCC | CCL-2.2 | |
| C2C12 | ATCC | CRL-1772 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Spinner | Corning | 778531 | |
| Homogenizer : Dounce homogenizer | Wheaton | 432-1273 and 432-1271 | |
| Agitating device for spinners | Bellco | 778531 | |
| Sonicator | Diagenode | UCD 200 | |
| Hemocytometer | Marienfeld Superior | 640610 | |
| Low-binding tubes | Sorenson | 27210 | |
| Empty spin column | Bio-Rad | 7326204 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| SDS-polyacrylamide 4-12 % gel | Life technologies | NP0336BOX | |
| 4X loading buffer | Life technologies | NP0007 | |
| 10X reducing agent | Life technologies | NP0004 | |
| Silver staining kit | Life technologies | A8592 | |
| Centrifugal filter units, 10K | Millipore | UFC501024 | |
| Protein G agarose beads | Sigma-Aldrich | P4691 | |
| Protein A/G Resin | Thermo Scientific | 53132 | |
| Flag resin (anti-Flag M2-agarose affinity gel) | Sigma-Aldrich | A2220 | |
| HA resin (monoclonal Anti-HA agarose) | Sigma-Aldrich | A2095 | |
| MNase | Sigma-Aldrich | N3755 | |
| Flag free peptide (DYKDDDDK) | Ansynth Service BV | Custom synthesis | Resuspend up to 4 mg/mL in 50 mM Tris-HCl, pH 7.8 |
| HA free peptide (YPYDVPDYA) | Ansynth Service BV | Custom synthesis | Resuspend up to 4 mg/mL in 50 mM Tris-HCl, pH 7.8 |
| Bicinchoninic acid based protein assay kit : BCA kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Protease inhibitors | Sigma-Aldrich | S8830 | |
| Luminol-based enhanced chemiluminescence (ECL) HRP substrate | Life technologies | 34075 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| Sheared salmon sperm DNA (Deoxyribonucleic acid sodium salt from salmon testes) | Sigma-Aldrich | D1626 | |
| Spermine tetrahydrochloride | Sigma-Aldrich | S1141 | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | S0266 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| MOPS running buffer | Life technologies | NP0001 | |
| DMEM (high glucose) | Sigma-Aldrich | D0822 | Pre-warm at 37 °C before use |
| Trypsin-EDTA (0.05% phenol red | Life technologies | 25300-054 | |
| Serum | GE healthcare life sciences | PAA A15-102 | Each lot of serum has to be first tested for your cells. |
| Penicillin and Streptomycin | Life technologies | 15140-122 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Life technologies | 15250-061 | |
| Water (sterile-filtered) | Sigma-Aldrich | W3500 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| HA from rat (12CA5) | Roche | 11583816001 | |
| Flag | Sigma-Aldrich | A8592 | |
| MyoD | Santa Cruz | sc-32758 | To use for western blotting |
| MyoD | Santa Cruz | SC-760 | To use for immunoprecipitation and western blotting |
| CBFbeta | Santa Cruz | FL-182 | |
| HP1alpha | Euromedex | 2HP2G9 | |
| HP1beta | Euromedex | 1MOD1A9AS | |
| HP1gamma | Euromedex | 2MOD1GC | |
| Suv39h1 | Cell Signaling Technology | 8729 | |
| BAF47 | BD Biosciences | 612111 | |
| Myf5 | Santa Cruz | SC-302 | |
| Tubulin | Sigma-Aldrich | T9026 | |
| Actin | Sigma-Aldrich | A5441 | |
| IgG Mouse | Santa Cruz | SC-2025 | |
| IgG Rabbit | Santa Cruz | SC-2027 | |
| Goat anti-rat -HRP | Sigma-Aldrich | A9037 | |
| Goat anti-rabbit -HRP | Sigma-Aldrich | A6154 | |
| Goat anti-mouse -HRP | Sigma-Aldrich | A4416 |
References
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