Identifisering av myod interactome Bruke Tandem Affinity Rensing Koblet til massespektrometri
Summary
MyoD is a myogenic transcription factor with a strong capacity to induce myogenic transdifferentiation of many fully differentiated non-muscle cell lines. The epigenetic mechanisms involved in this transdifferentiation are largely unknown. Here we describe a double-affinity purification method followed by mass spectrometry to exhaustively characterize MyoD partners.
Abstract
Skjelettmuskulatur terminal differensiering starter med engasjement av pluripotente mesodermal forløper celler til myoblasts. Disse cellene har fortsatt muligheten til å spre seg, eller de kan differensiere og sikring i multinucleated myotubes, som maturate ytterligere å danne myofibers. Skjelettmuskulatur terminal differensiering er orkestrert av koordinert aksjon av ulike transkripsjonsfaktorer, spesielt medlemmer av Muscle regulatoriske forhold eller MRFs (myod, Myogenin, Myf5, og MRF4), også kalt myogenisk bHLH transkripsjonsfaktorer familien. Disse faktorene samarbeide med kromatin-remodeling komplekser innen forseggjort transkripsjonen regulatoriske nettverk for å oppnå skjelett myogenesen. I denne er myod anses master myogenic transkripsjonsfaktor i utløser muskel terminal differensiering. Denne oppfatningen styrkes av evnen til myod å konvertere ikke-muskelceller i skjelettmuskelceller. Her beskriver vi en tilnærming som brukes til å identifisere myodproteinpartnere i en uttømmende måte for å belyse de forskjellige faktorer som er involvert i skjelettmuskel terminal differensiering. Det langsiktige målet er å forstå de epigenetiske mekanismene som er involvert i reguleringen av skjelettmuskel gener, altså., Myod mål. Myod partnere er identifisert ved hjelp av Tandem Affinity Rensing (TAP-tag) fra et heterologt system koblet til massespektrometri (MS) karakterisering, etterfulgt av validering av rollen til aktuelle samarbeidspartnere i løpet av skjelettmuskulatur terminal differensiering. Avvikende former for myogeniske faktorer, eller deres avvikende regulering, er forbundet med en rekke muskelsykdommer: medfødt gravis, myotonic dystrofi, rhabdomyosarkom og mangler i muskel regenerasjon. Som sådan, myogeniske faktorene gir en pool av potensielle terapeutiske mål i muskelsykdommer, både med hensyn til mekanismene som forårsaker sykdommen selv og regenerative mekanismer som kan forbedre sykdom behandling. Således, den detaljerte Forståelsending av de intermolekylære interaksjoner og de genetiske programmer styrt av myogeniske faktorer er avgjørende for den rasjonelle utforming av effektive terapier.
Introduction
Eukaryote flercellede organismer som er sammensatt av forskjellige organer og vev. Alle de funksjonelle vev har en bestemt gen mønster uttrykk, som bestemmes ved hvert differensiering trinn. Cellulær differensiering innebærer aktivering av spesifikke gener, opprettholdelse av deres ekspresjon og, generelt, tie av et sett av gener, for eksempel de som er involvert i celleformering. Skjelettmuskel differensiering, eller myogenese, er således en flertrinnsprosess, som begynner med å bestemme mesodermal stamceller i myoblaster, og deretter fører til terminal differensiering av disse myoblaster i første mono-kjernedannelse, og deretter flerkjernedannelse, myotubes . Dermed myoblasts er "bestemt" celler, som fremdeles er i stand til å spre seg, men de er forpliktet til skjelettmuskulatur avstamning, og dermed kan skille utelukkende i skjelettmuskelceller enten under embryonal utvikling eller i voksen muskel regenerasjon. Fremgangsmåten i skjelettmuskulatur terminal avvikeentiation er organisert med en spesifikk genetisk program som begynner med den permanente utgang fra cellesyklusen av myoblast forløperceller som fører til en definitiv stanse av sprednings forbundet gener, slik som E2F målgener 1. Faktisk, under prosessen med terminal differensiering, er myoblast spredning arrest et avgjørende skritt som går forut for uttrykket av skjelettmuskel spesifikke gener og sammensmeltingen av myoblasts inn myotubes 2. Et slikt program tillater voksne muskel stamceller, også kalt satellittceller, for å differensiere under regenereringen følgende skjelettmuskelskader.
Pattedyr myogenesen er kritisk avhengig av en familie av myogenic grunnleggende helix-loop-helix (bHLH) transkripsjon faktorer myod, Myf5, MRF4 og Myogenin, ofte referert til som familien av skjelettmuskelbestemmelsesfaktorer eller MRFs (Muscle regulatoriske forhold) 3. Hver av dem spiller en viktig rolle i spesifikasjon og differentiation av skjelettmuskelceller og har et bestemt uttrykk M.4 5-7. Aktivering av Myf5 og myod utgjør bestemmende trinnet som forplikter celler til myogenisk avstamning, og påfølgende uttrykk for Myogenin utløser myogenesen med aktivering av skjelettmuskel spesifikke gener som MCK (Muscle kreatin kinase). Myogeniske bHLH transkripsjonsfaktorer samarbeide med medlemmer av MEF2 familien i aktivering av muskel gener fra tidligere taus loci 8. De har også stimulere skjelettmuskel gentranskripsjon som heterodimerer med allestedsnærværende bHLH proteiner, E12 og E47, kjent som E proteiner som binder såkalte E-bokser i ulike gen-regulatoriske regioner 8. Twist, Id (hemmer av differensiering) og andre faktorer negativt regulere denne prosessen, ved å konkurrere med myod for E proteiner bindende 8.
Myod er regnet som den store spilleren i utløser muskel terminal differensiering 9 </sopp> siden det har kapasitet til å indusere en myogenic bestemmelse / differensiering (trans-differensiering) program i mange fullt differensierte ikke-muskel-systemer 10-13. Faktisk tvunget uttrykk for myod induserer trans-differensiering av ulike celletyper, selv de som stammer fra en annen embryologic opprinnelse 12. For eksempel kan myod konvertere hepatocytter, fibroblaster, melanocytter, neuroblasts og adipocytter i muskel-lignende celler. Den trans-differensierende virkning av myod innebærer en unormal aktivering av myogenisk genetisk program (særlig dets målgener) i et ikke-muskulær miljø, samtidig til den stanse av den opprinnelige genetisk program (særlig, spredning gener).
I prolifererende myoblasts er myod uttrykk, men er ikke i stand til å aktivere sine mål gener selv når det binder seg til sine arrangører 14-16. Derfor er det behov for myod å være kontinuerlig uttrykkes i udifferensierte myoblaster forblir ganske elubart. Myod kunne undertrykke sine mål gener på grunn av rekruttering av undertrykkende kromatin modifiserende enzymer i prolifererende myoblasts før lasting av aktivering kromatin remodelle enzymer 14,17. For eksempel, i voksende myoblasts er myod forbundet med transcriptional co-repressor KAP-en, histone deacetylases (HDACs) og undertrykkende lysin metyltransferaser (kmts), inkludert histon H3 lysin 9 eller H3K9 og H3K27 kmts, og aktivt undertrykke sin målgener uttrykk ved å etablere et lokalt undertrykkende kromatinstruktur 14,17. Viktigere, en fersk rapport indikerte at myod selv er direkte metylert ved H3K9 KMT G9a resulterer i hemming av sin transaktive aktivitet 16.
Den epigenetiske mekanismer som er involvert i denne transdifferensiering av ikke-muskelceller etter myod er stort sett ukjent. Spesielt, noen cellelinjer er resistent mot myod-indusert trans-differensiering. Derfor, i HeLa-celler, er myod enten deaktivert ellerselv kan fungere som repressor snarere enn aktivator av transkripsjon grunn av mangel på ekspresjon av BAF60C subenhet av kromatin remodeling komplekset SWI / SNF 18. Denne modellen kan dermed være av valg å bedre karakter mekanismene for myod-indusert gen undertrykkelse. Det er også egnet til å analysere muligheten for myod å indusere undertrykkende kromatin miljø på sitt mål loci med tilhørende partnere og dermed avdekke myod avhengige undertrykkende mekanismer i prolifererende myoblasts å finjustere terminal differensiering.
Her beskriver vi protokollen for identifisering av myod partnere ved hjelp Tandem Affinity Rensing (TAP-Tag) koblet til massespektrometri (MS) karakterisering. Bruken av HeLa-S3 celler som stabilt uttrykker Flag-HA-myod tillates å få nok materiale til å rense myod komplekser fra fraksjonerte nukleære ekstrakter. Identifiseringen av myod partnere i heterologe systemet ble etterfulgt av validatipå i et aktuelt system.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den presenterte metoden tillater uttømmende identifisering av partnere av en transkripsjonsfaktor, myod. Det avslørte myod partnere i et heterologt system motstandsdyktig mot myod-indusert differensiering, nemlig HeLa-S3 celler. Dermed, per definisjon, identifiserte myod partnere er allestedsnærværende uttrykt. Disse omfatter de generelle og sekvensspesifikke transkripsjonsfaktorer, kromatin-modifiserende enzymer, RNA prosessering proteiner, kinaser (tabell 1 og 2). Siden HeLa-S3 ce…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Work in the Ait-Si-Ali lab was supported by the Association Française contre les Myopathies Téléthon (AFM-Téléthon); Institut National du Cancer (INCa); Agence Nationale de la Recherche (ANR), Fondation Association pour la Recherche sur le Cancer (Fondation ARC); Groupement des Entreprises Françaises pour la Lutte contre le Cancer (GEFLUC); CNRS; Université Paris Diderot and the ”Who Am I?” Laboratory of Excellence #ANR-11- LABX-0071 funded by the French Government through its ”Investments for the Future” program operated by the ANR under grant #ANR-11-IDEX-0005-01. EB was supported by an INCa grant.
Materials
| Cell lines | |||
| HeLa-S3 | ATCC | CCL-2.2 | |
| C2C12 | ATCC | CRL-1772 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Spinner | Corning | 778531 | |
| Homogenizer : Dounce homogenizer | Wheaton | 432-1273 and 432-1271 | |
| Agitating device for spinners | Bellco | 778531 | |
| Sonicator | Diagenode | UCD 200 | |
| Hemocytometer | Marienfeld Superior | 640610 | |
| Low-binding tubes | Sorenson | 27210 | |
| Empty spin column | Bio-Rad | 7326204 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| SDS-polyacrylamide 4-12 % gel | Life technologies | NP0336BOX | |
| 4X loading buffer | Life technologies | NP0007 | |
| 10X reducing agent | Life technologies | NP0004 | |
| Silver staining kit | Life technologies | A8592 | |
| Centrifugal filter units, 10K | Millipore | UFC501024 | |
| Protein G agarose beads | Sigma-Aldrich | P4691 | |
| Protein A/G Resin | Thermo Scientific | 53132 | |
| Flag resin (anti-Flag M2-agarose affinity gel) | Sigma-Aldrich | A2220 | |
| HA resin (monoclonal Anti-HA agarose) | Sigma-Aldrich | A2095 | |
| MNase | Sigma-Aldrich | N3755 | |
| Flag free peptide (DYKDDDDK) | Ansynth Service BV | Custom synthesis | Resuspend up to 4 mg/mL in 50 mM Tris-HCl, pH 7.8 |
| HA free peptide (YPYDVPDYA) | Ansynth Service BV | Custom synthesis | Resuspend up to 4 mg/mL in 50 mM Tris-HCl, pH 7.8 |
| Bicinchoninic acid based protein assay kit : BCA kit | Thermo Scientific | 23225 | |
| Protease inhibitors | Sigma-Aldrich | S8830 | |
| Luminol-based enhanced chemiluminescence (ECL) HRP substrate | Life technologies | 34075 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| Sheared salmon sperm DNA (Deoxyribonucleic acid sodium salt from salmon testes) | Sigma-Aldrich | D1626 | |
| Spermine tetrahydrochloride | Sigma-Aldrich | S1141 | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | S0266 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| MOPS running buffer | Life technologies | NP0001 | |
| DMEM (high glucose) | Sigma-Aldrich | D0822 | Pre-warm at 37 °C before use |
| Trypsin-EDTA (0.05% phenol red | Life technologies | 25300-054 | |
| Serum | GE healthcare life sciences | PAA A15-102 | Each lot of serum has to be first tested for your cells. |
| Penicillin and Streptomycin | Life technologies | 15140-122 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Life technologies | 15250-061 | |
| Water (sterile-filtered) | Sigma-Aldrich | W3500 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| HA from rat (12CA5) | Roche | 11583816001 | |
| Flag | Sigma-Aldrich | A8592 | |
| MyoD | Santa Cruz | sc-32758 | To use for western blotting |
| MyoD | Santa Cruz | SC-760 | To use for immunoprecipitation and western blotting |
| CBFbeta | Santa Cruz | FL-182 | |
| HP1alpha | Euromedex | 2HP2G9 | |
| HP1beta | Euromedex | 1MOD1A9AS | |
| HP1gamma | Euromedex | 2MOD1GC | |
| Suv39h1 | Cell Signaling Technology | 8729 | |
| BAF47 | BD Biosciences | 612111 | |
| Myf5 | Santa Cruz | SC-302 | |
| Tubulin | Sigma-Aldrich | T9026 | |
| Actin | Sigma-Aldrich | A5441 | |
| IgG Mouse | Santa Cruz | SC-2025 | |
| IgG Rabbit | Santa Cruz | SC-2027 | |
| Goat anti-rat -HRP | Sigma-Aldrich | A9037 | |
| Goat anti-rabbit -HRP | Sigma-Aldrich | A6154 | |
| Goat anti-mouse -HRP | Sigma-Aldrich | A4416 |
References
- Ait-Si-Ali, S., et al. A Suv39h-dependent mechanism for silencing S-phase genes in differentiating but not in cycling cells. Embo J. 23 (3), 605-615 (2004).
- Buckingham, M. Skeletal muscle development and the role of the myogenic regulatory factors. Biochem Soc Trans. 24 (2), 506-509 (1996).
- Arnold, H. H., Winter, B. Muscle differentiation: more complexity to the network of myogenic regulators. Curr Opin Genet Dev. 8 (5), 539-544 (1998).
- Buckingham, M. Skeletal muscle formation in vertebrates. Curr Opin Genet Dev. 11 (4), 440-448 (2001).
- Yun, K., Wold, B. Skeletal muscle determination and differentiation: story of a core regulatory network and its context. Curr Opin Cell Biol. 8 (6), 877-889 (1996).
- Molkentin, J. D., Olson, E. N. Defining the regulatory networks for muscle development. Curr Opin Genet Dev. 6 (4), 445-453 (1996).
- Arnold, H. H., Braun, T. Targeted inactivation of myogenic factor genes reveals their role during mouse myogenesis: a review. Int J Dev Biol. 40 (1), 345-353 (1996).
- Puri, P. L., Sartorelli, V. Regulation of muscle regulatory factors by DNA-binding, interacting proteins, and post-transcriptional modifications. J Cell Physiol. 185 (2), 155-173 (2000).
- Tapscott, S. J. The circuitry of a master switch: Myod and the regulation of skeletal muscle gene transcription. Development. 132 (12), 2685-2695 (2005).
- Lassar, A. B., Paterson, B. M., Weintraub, H. Transfection of a DNA locus that mediates the conversion of 10T1/2 fibroblasts to myoblasts. Cell. 47 (5), 649-656 (1986).
- Davis, R. L., Weintraub, H., Lassar, A. B. Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts. Cell. 51, 987-1000 (1987).
- Tapscott, S. J., et al. MyoD1: a nuclear phosphoprotein requiring a myc homology region to convert fibroblasts to myoblasts. Science. 242, 405-411 (1988).
- Weintraub, H., et al. Activation of muscle-specific genes in pigment, nerve, fat, liver, and fibroblast cell lines by forced expression of MyoD. Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (14), 5434-5438 (1989).
- Mal, A., Harter, M. L. MyoD is functionally linked to the silencing of a muscle-specific regulatory gene prior to skeletal myogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (4), 1735-1739 (2003).
- Ohkawa, Y., Marfella, C. G., Imbalzano, A. N. Skeletal muscle specification by myogenin and Mef2D via the SWI/SNF ATPase Brg1. Embo J. 25 (3), 490-501 (2006).
- Ling, B. M., et al. Lysine methyltransferase G9a methylates the transcription factor MyoD and regulates skeletal muscle differentiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (3), 841-846 (2012).
- Zhang, C. L., McKinsey, T. A., Olson, E. N. Association of class II histone deacetylases with heterochromatin protein 1: potential role for histone methylation in control of muscle differentiation. Mol Cell Biol. 22 (20), 7302-7312 (2002).
- Forcales, S. V., et al. Signal-dependent incorporation of MyoD-BAF60c into Brg1-based SWI/SNF chromatin-remodelling complex. The EMBO journal. 31 (2), 301-316 (2011).
- Nakatani, Y., Ogryzko, V. Immunoaffinity purification of mammalian protein complexes. Methods Enzymol. 370, 430-444 (2003).
- Ouararhni, K., et al. The histone variant mH2A1.1 interferes with transcription by down-regulating PARP-1 enzymatic activity. Genes Dev. 20 (23), 3324-3336 (2006).
- Fritsch, L., et al. A subset of the histone H3 lysine 9 methyltransferases Suv39h1, G9a, GLP, and SETDB1 participate in a multimeric complex. Mol Cell. 37 (1), 46-56 (2010).
- Robin, P., Fritsch, L., Philipot, O., Svinarchuk, F., Ait-Si-Ali, S. Post-translational modifications of histones H3 and H4 associated with the histone methyltransferases Suv39h1 and G9a. Genome Biol. 8 (12), R270 (2007).
- Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat Protoc. 4 (1), 44-57 (2009).
- Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists. Nucleic Acids Res. 37 (1), 1-13 (2009).
- Ohta, S., et al. The protein composition of mitotic chromosomes determined using multiclassifier combinatorial proteomics. Cell. 142 (5), 810-821 (2010).
- Yahi, H., et al. Differential cooperation between heterochromatin protein HP1 isoforms and MyoD in myoblasts. J Biol Chem. 283 (35), 23692-23700 (2008).
- Philipot, O., et al. The core binding factor CBF negatively regulates skeletal muscle terminal differentiation. PloS one. 5 (2), (2010).
- Joliot, V., et al. The SWI/SNF subunit/tumor suppressor BAF47/INI1 is essential in cell cycle arrest upon skeletal muscle terminal differentiation. PloS one. 9 (10), e108858 (2014).
- Tanese, N. Small-scale density gradient sedimentation to separate and analyze multiprotein complexes. Methods. 12 (3), 224-234 (1997).
- Singh, K., et al. A KAP1 phosphorylation switch controls MyoD function during skeletal muscle differentiation. Genes Dev. 29 (5), 513-525 (2015).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Yahi, H., Philipot, O., Guasconi, V., Fritsch, L., Ait-Si-Ali, S. Chromatin modification and muscle differentiation. Expert Opin Ther Targets. 10 (6), 923-934 (2006).
- Sun, L., Liu, L., Yang, X. J., Wu, Z. Akt binds prohibitin 2 and relieves its repression of MyoD and muscle differentiation. J Cell Sci. 117. 117 (Pt 14), 3021-3029 (2004).
- Caretti, G., et al. The RNA helicases p68/p72 and the noncoding RNA SRA are coregulators of MyoD and skeletal muscle differentiation. Dev Cell. 11 (4), 547-560 (2006).
- Knoepfler, P. S., et al. A conserved motif N-terminal to the DNA-binding domains of myogenic bHLH transcription factors mediates cooperative DNA binding with pbx-Meis1/Prep1. Nucleic Acids Res. 27 (18), 3752-3761 (1999).
- Albini, S., Puri, P. L. SWI/SNF complexes, chromatin remodeling and skeletal myogenesis: it’s time to exchange!. Exp Cell Res. 316 (18), 3073-3080 (2010).
- Yahi, H., Fritsch, L., Philipot, O., Guasconi, V., Souidi, M., Robin, P., Polesskaya, A., Losson, R., Harel-Bellan, A., Ait-Si-Ali, S. Differential Cooperation between Heterochromatin Protein HP1 Isoforms and MyoD in Myoblasts. J Biol Chem. 283 (35), 23692-23700 (2008).
