Administração intra-traqueal de<em> Haemophilus influenzae</em> No mouse modelos para o Estudo de inflamação das vias aéreas
Summary
We demonstrate the procedure for intra-tracheal inoculation of Haemophilus influenzae into the lower respiratory tracts of mice. This is a very useful tool to study signaling pathways that regulate airway inflammation in mouse models.
Abstract
Aqui, descrevemos um procedimento detalhado de forma eficiente e entregar diretamente Haemophilus influenzae pelas vias respiratórias inferiores de ratos. Nós demonstramos o procedimento para a preparação H. influenzae inóculo, instilação intra-traqueal de H. influenzae para o pulmão, acúmulo de líquido bronco-alveolar lavagem (LBA), análise de células imunes no LBA, e isolamento de RNA para análise de expressão diferencial de genes. Este procedimento pode ser utilizado para estudar a resposta inflamatória do pulmão para qualquer bactérias, vírus ou fungos. A instilação traqueal directa é mais preferido mais de procedimentos de inalação de aerossóis intranasais ou porque mais eficiente proporciona o inoculo bacteriano para o tracto respiratório inferior com menos ambiguidade.
Introduction
A inflamação é um mecanismo de defesa imunitário fundamental da contra agentes infecciosos. Ela promove a erradicação do patógeno e reparação de tecidos danificados. Além disso, facilita a recuperação para um estado normal e saudável 1. No entanto, a inflamação desregulado muitas vezes leva a doenças inflamatórias crónicas 2. Inflamação das vias respiratórias é um gatilho inicial para diferentes doenças pulmonares tais como doença pulmonar obstrutiva crónica (DPOC), asma e fibrose pulmonar 3.
A influenzae não tipificável (não encapsulado) Haemophilus (NTHi) é associada com doenças inflamatórias superiores e inferiores do pulmão crónicas 4,5. É a espécie dominante isolados das vias aéreas inferiores de crianças e adultos com 4,6,7 doença pulmonar obstrutiva crónica. A resposta inflamatória após a infecção NTHi é caracterizado pela regulação positiva de citocinas pró-inflamatórias (tais como TNF e IL-1β), e é mediada by mitogen activated protein kinase (MAPK) e fator nuclear-kB (NF-kB) através de receptores toll-like (TLR) 8.
modelos de rato são ferramentas muito úteis para analisar a patologia subjacente de doença inflamatória do pulmão, devido à disponibilidade de linhas diferentes de genes deficientes. Vários métodos têm sido utilizados para inocular / bactérias vivas atenuadas e produtos bacterianos, incluindo a instilação intranasal e 9,10 inalação na forma de aerossol. Aqui, nós demonstramos a instilação intra-traqueal. Embora seja utilizada menos frequentemente, esta abordagem é mais eficiente e altamente reprodutível devido à entrega directa do inoculo para o tracto respiratório inferior.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui, nós descrevemos um procedimento único e minimamente invasivo para inocular os pulmões de ratinhos com um agente patogénico bacteriano pulmão. Nós demonstramos que este procedimento pode ser utilizado para estudar a função de genes diferentes que utilizam ratinhos que são deficientes em genes de vias de sinalização inflamatórias. Este procedimento também pode ser usado para estudar as respostas inflamatória a infecções pulmonares virais e fúngicas. As vantagens deste processo em relação aos outro…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Dr. Carson Harrod for critical reading of the manuscript. We also thank Mr. Minghui Zeng and Drs. Mahesh Kathania and Prashant Khare for their contributions. This work was supported by grants from the American Cancer Society (Research Scholar grant, 122713-RSG-12-260-01-LIB) and the Sammons Cancer Center (Pilot Project grant) to K. Venuprasad.
Materials
| Chocolate agar plate | Fisher Scientific | CAS50-99-7 | |
| Dextrose Anhydrous | Themo Scientific | R01300 | |
| Heparin | Hospira,Inc | RL-3010 | |
| Deft quick solution | Sigma | GS500-500ML | |
| Syringe needle 20/26G | BD | (REF305115/175) | |
| Iml syringe | BD | REF 309602 | |
| Catheter 20GA | BD | REF 381433 | |
| Dissecting Scissors, straight, 10 cm long | kentscientific | INS600393 | |
| Iris Forceps, serrated, 10cm long | kentscientific | INS650915 | |
| Tweezer #5 Stainless steel, 11cm long | kentscientific | INS600095 | |
| 10% Formalin | Fisher Scientific | CAS 67-56-1 | |
| Agarose | peqlab | 35-1020 | |
| 5ml polystyrene round-bottom tubes | BD | REF 352058 | |
| 1.5 ml Microcentrifuge tubes | Light Labs | A-7001-R | |
| Reasy Mini kit | Qiagen | 74104 | |
| Pellet pestile motor (Tissue homoginizer) | Sigma | Z359971-1EA | |
| 96 well microtiter plates V bottom | Thermo | 2605 | |
| 1X PBS | Gibco | 10010-023 | |
| OneComp eBeads | eBioscience | 01-1111-42 | |
| CD45.2-APC | eBioscience | 17-0454-81 | Working dilution 1:100 |
| Ly-6G-eFlor 450 | eBioscience | 48-5931-82 | Working dilution 1:100 |
| BSA | HyClone | SH30574.03 | |
| RBC Lysis Buffer (10X) | Biolegend | 420301 | |
| Live/Dead fixable aqua dead cell stain kit | Invitrogen | L-34957 | |
| EDTA (0.5M) | lifetechnologies | 15575-020 | |
| CD16/CD32 FcBlock | BD | 553142 | |
| Facs tubes polystyrene round bottom tube | BD | 352052 | |
| Formaldehyde | Polyscience | 4018 |
References
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