JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

سيكلوهيكسيميد تحليل تشيس من تدهور البروتين في<em> خميرة الخباز</em

Published: April 18, 2016
doi:
10.3791/53975
, , ,
1Department of Biology,Ball State University, 2Bioproduct Research & Development,Eli Lilly and Company

Summary

Protein abundance reflects the rates of both protein synthesis and protein degradation. This article describes the use of cycloheximide chase followed by western blotting to analyze protein degradation in the model unicellular eukaryote, Saccharomyces cerevisiae (budding yeast).

Abstract

تنظيم وفرة البروتين ضروري لكل عملية الخلوية تقريبا. تعكس البروتين وفرة التكامل بين معدلات تخليق البروتين وتدهور البروتين. العديد من فحوصات الإبلاغ عن وفرة البروتين (على سبيل المثال، لمرة واحدة نقطة النشاف الغربي، وتدفق الخلوي، المجهري مضان، أو المقايسات مراسل القائم على النمو) لا تسمح التمييز من آثار النسبية للترجمة والتحلل البروتيني على مستويات البروتين. توضح هذه المقالة استخدام مطاردة سيكلوهيكسيميد تليها الغربية النشاف لتحليل تحديدا تدهور البروتين في حقيقي النواة وحيدة الخلية النموذجية، خميرة الخباز (مهدها الخميرة). في هذا الإجراء، يتم تحضين الخلايا الخميرة في وجود سيكلوهيكسيميد متعدية المانع. يتم جمع أجزاء مأخوذة من خلايا مباشرة بعد وعند نقاط زمنية محددة بعد إضافة سيكلوهيكسيميد. وهي lysed الخلايا، ويتم فصل لست] من قبل الكهربائي للهلام بولي أكريلاميد FOص تحليل لطخة الغربي من وفرة البروتين في كل نقطة زمنية. يسمح الإجراء سيكلوهيكسيميد مطاردة تصور حركية تدهور سكان الولاية ثابت من مجموعة متنوعة من البروتينات الخلوية. ويمكن استخدام هذا الإجراء لتحقيق متطلبات الوراثية للوالتأثيرات البيئية على تدهور البروتين.

Introduction

البروتينات تؤدي وظائف مهمة في كل عملية الخلوية تقريبا. تتطلب العديد من العمليات الفسيولوجية وجود بروتين معين (أو البروتينات) لفترة محددة من الزمن أو في ظل ظروف معينة. لذا الكائنات مراقبة وتنظيم وفرة البروتين لتلبية احتياجات الخلوية 1. على سبيل المثال، الحلقيات (البروتينات التي تتحكم في انقسام الخلايا) موجودة في مراحل محددة من دورة الخلية، وارتبط فقدان مستويات السيكلين المنظمة مع تشكيل الورم الخبيث 2. بالإضافة إلى تنظيم مستويات البروتين لتلبية احتياجات الخلوية، وخلايا توظف آليات الهادمة لمراقبة الجودة للقضاء تتجمع، غير المجمعين، أو الشاذة إلا جزيئات البروتين 3. السيطرة على وفرة البروتين ينطوي على تنظيم كل من تخليق الجزيئات (النسخ والترجمة) وتدهور (RNA الانحلال والتحلل البروتيني). ضعف أو الإفراط في تدهور البروتين يساهم في أمراض متعددة، بما في ذلك السرطان، والتليف الكيسي، والظروف العصبية، واضطرابات القلب والأوعية الدموية 4-8. وبالتالي تمثل آليات بروتين الأهداف العلاجية واعدة لمجموعة من الأمراض 9-12.

تحليل البروتينات عند نقطة زمنية واحدة (على سبيل المثال، لطخة الغربية 13، وتدفق الخلوي 14، أو المجهري مضان 15) على لقطة من مطردة البروتين وفرة الدولة دون الكشف عن الإسهامات النسبية للتركيب أو تدهورها. وبالمثل، تعكس المقايسات مراسل القائم على نمو مستويات البروتين حالة مستقرة على مدى فترة زمنية طويلة دون التمييز بين تأثيرات التوليف وتدهور 15-20. فمن الممكن أن نستنتج مساهمة العمليات الهادمة لمستويات البروتين حالة مستقرة من خلال مقارنة وفرة قبل وبعد تثبيط مكونات محددة لآلية الهادمة (على سبيل المثال، عن طريق تعطيل دواء والمتواجدكتبها asome 21 أو ضرب الجينات افترض أن تكون هناك حاجة لتدهور 13). أي تغيير في مستويات البروتين حالة مستقرة بعد تثبيط مسارات الهادمة دليلا قويا للمساهمة التحلل البروتيني إلى السيطرة على البروتين وفرة 13. ومع ذلك، فإن مثل هذا التحليل لا يزال لا يوفر معلومات حول حركية دوران البروتين. مطاردة سيكلوهيكسيميد تليها الغربية النشاف تتغلب على نقاط الضعف هذه من خلال السماح للباحثين لتصور تدهور البروتين مع مرور الوقت 22-24. وعلاوة على ذلك، لأنه كشف عن البروتين بعد مطاردة سيكلوهيكسيميد تتم عادة من قبل النشاف الغربي، النظائر المشعة والخطوات مناعي طويلة ليست مطلوبة لمطاردة سيكلوهيكسيميد، على عكس العديد من التقنيات مطاردة نبض شيوعا، والتي تتم أيضا إلى تصور تدهور البروتين 25.

وقد تم تحديد سيكلوهيكسيميد أولا كمركب مع المضادة للفطريات السليمالعلاقات التي تنتجها السبحية البكتيريا إيجابية الجرام سنجابي 26،27. وهو جزيء خلايا قابلة للاختراق الذي يمنع على وجه التحديد عصاري خلوي حقيقيات النوى (ولكن ليس organellar) الترجمة عن طريق إضعاف الريباسي النبات 28-31. في تجربة سيكلوهيكسيميد مطاردة، يضاف سيكلوهيكسيميد إلى الخلايا، ويتم جمع aliquots من الخلايا فورا وعند نقاط زمنية محددة بعد إضافة مركب 22. وهي lysed الخلايا، ويتم تحليل وفرة البروتين في كل نقطة زمنية، وعادة من قبل لطخة غربية. انخفاض في وفرة البروتين بعد إضافة سيكلوهيكسيميد يمكن أن يعزى بثقة إلى تدهور البروتين. سوف بروتين غير مستقر نقصان في وفرة مع مرور الوقت، في حين أن البروتين مستقر نسبيا سوف يحمل تغيرا طفيفا في وفرة.

وقد آليات تدهور البروتين انتقائية الحفظ جدا في جميع أنحاء حقيقيات النوى. وعلم لأول مرة بكثير من ما هو معروف عن تدهور البروتين فيوحقيقي النواة وحيدة الخلية نموذج، خميرة الخباز (مهدها الخميرة) 25،32-36. ومن المرجح أن يواصل تقديم رؤى جديدة وهامة في تدهور البروتين الدراسات مع الخميرة. تم توضيح طريقة لمطاردة سيكلوهيكسيميد في خلايا الخميرة يليه تحليل لطخة الغربي من وفرة البروتين هنا.

Protocol

1. النمو والحصاد من خلايا الخميرة إن لم يكن تحليل حركية تدهور بروتين الخميرة الذاتية، وتحويل الخميرة المطلوب سلالة (s) مع ترميز البلازميد بروتين من الفائدة. وقد وصفت وسائل موثوق بها للتحول الخميرة سابقا 37. <li styl…

Representative Results

لتوضيح منهجية مطاردة سيكلوهيكسيميد، تم تحليل استقرار Deg1 -Sec62 (الشكل 1)، وهذا نموذج الخميرة الشبكة الإندوبلازمية (أوروبا) تدهور -associated (ايراد) الركيزة، 42-44. في ايراد، ومراقبة الجودة الانزيمات اليوبيكويتين يغاز إرفاق تساهمي سلاسل م?…

Discussion

في هذه الورقة، وتقدم طريقة لتحليل حركية تدهور البروتين. هذه التقنية يمكن تطبيقها بسهولة إلى مجموعة من البروتينات التي تدهورت بفعل مجموعة متنوعة من الآليات. من المهم أن نلاحظ أن التجارب سيكلوهيكسيميد مطاردة تقرير عن حركية تدهور تجمع الدولة المطرد للبروتين معين. ويمك…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors thank current and former members of the Rubenstein lab for providing a supportive and enthusiastic research environment. The authors thank Mark Hochstrasser (Yale University) for sharing reagents and expertise. E.M.R. thanks Stefan Kreft (University of Konstanz) and Jennifer Bruns (University of Pittsburgh) for sharing invaluable expertise in kinetic analysis of proteins. This work was supported by a National Institutes of Health grant (R15 GM111713) to E.M.R., a Ball State University ASPiRE research award to E.M.R, a research award from the Ball State University chapter of Sigma Xi to S.M.E., and funds from the Ball State University Provost’s Office and Department of Biology.

Materials

Desired yeast strains, plasmids, standard medium and buffer components
Disposable borosilicate glass tubes Fisher Scientific 14-961-32 Available from a variety of manufacturers
Temperature-regulated incubator (e.g. Heratherm Incubator Model IMH180) Dot Scientific 51028068 Available from a variety of manufacturers
New Brunswick Interchangeable Drum for 18 mm tubes (tube roller) New Brunswick M1053-0450 A tube roller is recommended to maintain overnight  starter cultures of yeast cells in suspension. Alternatively, if a tube roller is unavailable, a platform shaker in a temperature-controlled incubator may be used for overnight starter cultures. A platform shaker or tube roller may be used to maintain larger cultures in suspension.
New Brunswick TC-7 Roller Drum 120V 50/60 H New Brunswick M1053-4004 For use with tube roller
SmartSpec Plus Spectrophotometer Bio-Rad 170-2525 Available from a variety of manufacturers
Centrifuge 5430 Eppendorf 5427 000.216  Rotor that is sold with unit holds 1.5- and 2.0-ml microcentrifuge tubes. Rotor may be swapped for one that holds 15- and 50-ml conical tubes
Fixed-Angle Rotor F-35-6-30 with Lid and Adapters for Centrifuge Model 5430/R, 15/50 mL Conical Tubes, 6-Place Eppendorf F-35-6-30
15-ml screen printed screw cap tube 17 x 20 mm conical, polypropylene Sarstedt 62.554.205 Available from a variety of manufacturers
1.5-ml flex-tube, PCR clean, natural microcentrifuge tubes Eppendorf 22364120 Available from a variety of manufacturers
Analog Dri-Bath Heaters Fisher Scientific 1172011AQ It is recomended that two heaters are available (one for incubating cells during cycloheximide treatment and one for boiling lysates to denature proteins). Alternatively, 30 °C water bath may be used for incubation of cells in the presence of cycloheximide. Boiling water bath with hot plate may altertnatively be used to denature proteins.
Heating block for 12 x 15-ml conical tubes Fisher Scientific 11-473-70 For use with Dri-Bath Heater during incubation of cells in the presence of cycloheximide.
Heating block for 20 x 1.5-ml conical tubes Fisher Scientific 11-718-9Q For use with Dri-Bath Heater to boil lysates for protein denaturation.
SDS-PAGE running and transfer apparatuses, power supplies, and imaging equipment or darkrooms for SDS-PAGE and transfer to membrane Will vary by lab and application
Western blot imaging system (e.g. Li-Cor Odyssey CLx scanner and Image Studio Software) Li-Cor 9140-01 Will vary by lab and application
EMD Millipore Immobilon PVDF Transfer Membranes Fisher Scientific IPFL00010 Will vary by lab and application
Primary antibodies (e.g. Phosphoglycerate Kinase (Pgk1) Monoclonal antibody, mouse (clone 22C5D8)) Life Technologies 459250 Will vary by lab and application
Secondary antibodies (e.g. Alexa-Fluor 680 Rabbit Anti-Mouse IgG (H+L)) Life Technologies A-21065 Will vary by lab and application
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jankowska, E., Stoj, J., Karpowicz, P., Osmulski, P. A., Gaczynska, M. The proteasome in health and disease. Cur Pharm Des. 19 (6), 1010-1028 (2013).
  2. Nakayama, K. I., Nakayama, K. Ubiquitin ligases: cell-cycle control and cancer. Nat Rev Cancer. 6 (5), 369-381 (2006).
  3. Amm, I., Sommer, T., Wolf, D. H. Protein quality control and elimination of protein waste: the role of the ubiquitin-proteasome system. Biochim Biophys Acta. 1843 (1), 182-196 (2014).
  4. Goldberg, A. L. Protein degradation and protection against misfolded or damaged proteins. Nature. 426 (6968), 895-899 (2003).
  5. Guerriero, C. J., Brodsky, J. L. The delicate balance between secreted protein folding and endoplasmic reticulum-associated degradation in human physiology. Physiol Rev. 92 (2), 537-576 (2012).
  6. Pagan, J., Seto, T., Pagano, M., Cittadini, A. Role of the ubiquitin proteasome system in the heart. Circ Res. 112 (7), 1046-1058 (2013).
  7. Rubinsztein, D. C. The roles of intracellular protein-degradation pathways in neurodegeneration. Nature. 443 (7113), 780-786 (2006).
  8. Turnbull, E. L., Rosser, M. F., Cyr, D. M. The role of the UPS in cystic fibrosis. BMC Biochem. 8 Suppl 1, S11 (2007).
  9. Bedford, L., Lowe, J., Dick, L. R., Mayer, R. J., Brownell, J. E. Ubiquitin-like protein conjugation and the ubiquitin-proteasome system as drug targets. Nat Rev Drug Discov. 10 (1), 29-46 (2011).
  10. Kar, G., Keskin, O., Fraternali, F., Gursoy, A. Emerging role of the ubiquitin-proteasome system as drug targets. Curr Pharm Des. 19 (18), 3175-3189 (2013).
  11. Paul, S. Dysfunction of the ubiquitin-proteasome system in multiple disease conditions: therapeutic approaches. BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 30 (11-12), 1172-1184 (2008).
  12. Shen, M., Schmitt, S., Buac, D., Dou, Q. P. Targeting the ubiquitin-proteasome system for cancer therapy. Expert Opin Ther Targets. 17 (9), 1091-1108 (2013).
  13. Crowder, J. J., et al. Rkr1/Ltn1 Ubiquitin Ligase-Mediated Degradation of Translationally Stalled Endoplasmic Reticulum Proteins. J Biol Chem. 290 (30), 18454-18466 (2015).
  14. Gardner, R. G., et al. Endoplasmic reticulum degradation requires lumen to cytosol signaling. Transmembrane control of Hrd1p by Hrd3p. J Cell Biol. 151 (1), 69-82 (2000).
  15. Metzger, M. B., Maurer, M. J., Dancy, B. M., Michaelis, S. Degradation of a cytosolic protein requires endoplasmic reticulum-associated degradation machinery. J Biol Chem. 283 (47), 32302-32316 (2008).
  16. Watts, S. G., Crowder, J. J., Coffey, S. Z., Rubenstein, E. M. Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae. J Vis Exp. (96), e52428 (2015).
  17. Cohen, I., Geffen, Y., Ravid, G., Ravid, T. Reporter-based growth assay for systematic analysis of protein degradation. J Vis Exp. (93), e52021 (2014).
  18. Ravid, T., Kreft, S. G., Hochstrasser, M. Membrane and soluble substrates of the Doa10 ubiquitin ligase are degraded by distinct pathways. EMBO J. 25 (3), 533-543 (2006).
  19. Kohlmann, S., Schafer, A., Wolf, D. H. Ubiquitin ligase Hul5 is required for fragment-specific substrate degradation in endoplasmic reticulum-associated degradation. J Biol Chem. 283 (24), 16374-16383 (2008).
  20. Medicherla, B., Kostova, Z., Schaefer, A., Wolf, D. H. A genomic screen identifies Dsk2p and Rad23p as essential components of ER-associated degradation. EMBO Rep. 5 (7), 692-697 (2004).
  21. Habeck, G., Ebner, F. A., Shimada-Kreft, H., Kreft, S. G. The yeast ERAD-C ubiquitin ligase Doa10 recognizes an intramembrane degron. J Cell Biol. 209 (2), 261-273 (2015).
  22. Tran, J. R., Brodsky, J. L. Assays to measure ER-associated degradation in yeast. Methods Mol Biol. 832, 505-518 (2012).
  23. Kao, S. H., et al. GSK3beta controls epithelial-mesenchymal transition and tumor metastasis by CHIP-mediated degradation of Slug. Oncogene. 33 (24), 3172-3182 (2014).
  24. Hampton, R. Y., Rine, J. Regulated degradation of HMG-CoA reductase, an integral membrane protein of the endoplasmic reticulum, in yeast. J Cell Biol. 125 (2), 299-312 (1994).
  25. Hochstrasser, M., Varshavsky, A. In vivo degradation of a transcriptional regulator: the yeast alpha 2 repressor. Cell. 61 (4), 697-708 (1990).
  26. Schneider-Poetsch, T., et al. Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin. Nat Chem Biol. 6 (3), 209-217 (2010).
  27. Whiffen, A. J., Bohonos, N., Emerson, R. L. The Production of an Antifungal Antibiotic by Streptomyces griseus. J Bacteriol. 52 (5), 610-611 (1946).
  28. Obrig, T. G., Culp, W. J., McKeehan, W. L., Hardesty, B. The mechanism by which cycloheximide and related glutarimide antibiotics inhibit peptide synthesis on reticulocyte ribosomes. J Biol Chem. 246 (1), 174-181 (1971).
  29. Ennis, H. L., Lubin, M. Cycloheximide: Aspects of Inhibition of Protein Synthesis in Mammalian Cells. Science. 146 (3650), 1474-1476 (1964).
  30. Kerridge, D. The effect of actidione and other antifungal agents on nucleic acid and protein synthesis in Saccharomyces carlsbergensis. J Gen Microbiol. 19 (3), 497-506 (1958).
  31. Chakrabarti, S., Dube, D. K., Roy, S. C. Effects of emetine and cycloheximide on mitochondrial protein synthesis in different systems. Biochem J. 128 (2), 461-462 (1972).
  32. Seufert, W., Jentsch, S. In vivo function of the proteasome in the ubiquitin pathway. EMBO J. 11 (8), 3077-3080 (1992).
  33. Varshavsky, A. Discovery of the biology of the ubiquitin system. JAMA. 311 (19), 1969-1970 (2014).
  34. Heinemeyer, W., Kleinschmidt, J. A., Saidowsky, J., Escher, C., Wolf, D. H. Proteinase yscE, the yeast proteasome/multicatalytic-multifunctional proteinase: mutants unravel its function in stress induced proteolysis and uncover its necessity for cell survival. EMBO J. 10 (3), 555-562 (1991).
  35. Sommer, T., Jentsch, S. A protein translocation defect linked to ubiquitin conjugation at the endoplasmic reticulum. Nature. 365 (6442), 176-179 (1993).
  36. Hiller, M. M., Finger, A., Schweiger, M., Wolf, D. H. ER degradation of a misfolded luminal protein by the cytosolic ubiquitin-proteasome pathway. Science. 273 (5282), 1725-1728 (1996).
  37. Gietz, R. D., Schiestl, R. H. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nature Protoc. 2 (1), 31-34 (2007).
  38. Bergman, L. W. Growth and maintenance of yeast. Methods Mol Biol. 177, 9-14 (2001).
  39. Biederer, T., Volkwein, C., Sommer, T. Degradation of subunits of the Sec61p complex, an integral component of the ER membrane, by the ubiquitin-proteasome pathway. EMBO J. 15 (9), 2069-2076 (1996).
  40. Kushnirov, V. V. Rapid and reliable protein extraction from yeast. Yeast. 16 (9), 857-860 (2000).
  41. Sharma, M., Benharouga, M., Hu, W., Lukacs, G. L. Conformational and temperature-sensitive stability defects of the delta F508 cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in post-endoplasmic reticulum compartments. J Biol Chem. 276 (12), 8942-8950 (2001).
  42. Mayer, T. U., Braun, T., Jentsch, S. Role of the proteasome in membrane extraction of a short-lived ER-transmembrane protein. EMBO J. 17 (12), 3251-3257 (1998).
  43. Rubenstein, E. M., Kreft, S. G., Greenblatt, W., Swanson, R., Hochstrasser, M. Aberrant substrate engagement of the ER translocon triggers degradation by the Hrd1 ubiquitin ligase. J Cell Biol. 197 (6), 761-773 (2012).
  44. Scott, D. C., Schekman, R. Role of Sec61p in the ER-associated degradation of short-lived transmembrane proteins. J Cell Biol. 181 (7), 1095-1105 (2008).
  45. Thibault, G., Ng, D. T. The endoplasmic reticulum-associated degradation pathways of budding yeast. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (12), (2012).
  46. Fisher, E. A., et al. The degradation of apolipoprotein B100 is mediated by the ubiquitin-proteasome pathway and involves heat shock protein 70. J Biol Chem. 272 (33), 20427-20434 (1997).
  47. Pariyarath, R., et al. Co-translational interactions of apoprotein B with the ribosome and translocon during lipoprotein assembly or targeting to the proteasome. J Biol Chem. 276 (1), 541-550 (2001).
  48. Yeung, S. J., Chen, S. H., Chan, L. Ubiquitin-proteasome pathway mediates intracellular degradation of apolipoprotein. B. Biochemistry. 35 (43), 13843-13848 (1996).
  49. Biederer, T., Volkwein, C., Sommer, T. Role of Cue1p in ubiquitination and degradation at the ER surface. Science. 278 (5344), 1806-1809 (1997).
  50. Metzger, M. B., et al. A structurally unique E2-binding domain activates ubiquitination by the ERAD E2, Ubc7p, through multiple mechanisms. Mol Cell. 50 (4), 516-527 (2013).
  51. Bazirgan, O. A., Hampton, R. Y. Cue1p is an activator of Ubc7p E2 activity in vitro and in vivo. J Biol Chem. 283 (19), 12797-12810 (2008).
  52. Kim, I., et al. The Png1-Rad23 complex regulates glycoprotein turnover. J Cell Biol. 172 (2), 211-219 (2006).
  53. Chen, P., Johnson, P., Sommer, T., Jentsch, S., Hochstrasser, M. Multiple ubiquitin-conjugating enzymes participate in the in vivo degradation of the yeast MAT alpha 2 repressor. Cell. 74 (2), 357-369 (1993).
  54. Jungmann, J., Reins, H. A., Schobert, C., Jentsch, S. Resistance to cadmium mediated by ubiquitin-dependent proteolysis. Nature. 361 (6410), 369-371 (1993).
  55. Tansey, W. P. Pulse-chase assay for measuring protein stability in yeast. Cold Spring Harb Protoc. , (2007).
  56. Hanna, J., Leggett, D. S., Finley, D. Ubiquitin depletion as a key mediator of toxicity by translational inhibitors. Mol Cell Biol. 23 (24), 9251-9261 (2003).
  57. Wilson, W. A., Hawley, S. A., Hardie, D. G. Glucose repression/derepression in budding yeast: SNF1 protein kinase is activated by phosphorylation under derepressing conditions, and this correlates with a high AMP:ATP ratio. Curr Biol. 6 (11), 1426-1434 (1996).
  58. Ashe, M. P., De Long, S. K., Sachs, A. B. Glucose depletion rapidly inhibits translation initiation in yeast. Mol Biol Cell. 11 (3), 833-848 (2000).
  59. Grant, C. M., MacIver, F. H., Dawes, I. W. Mitochondrial function is required for resistance to oxidative stress in the yeast Saccharomyces cerevisiae. FEBS Lett. 410 (2-3), 219-222 (1997).
  60. Javmen, A., et al. beta-Glucan from Saccharomyces cerevisiae Induces IFN-gamma Production In Vivo in BALB/c Mice. In Vivo. 29 (3), 359-363 (2015).
  61. Link, A. J., LaBaer, J. Trichloroacetic acid (TCA) precipitation of proteins. Cold Spring Harb Protoc. 2011 (8), 993-994 (2011).
  62. Hornbeck, P. V. Enzyme-Linked Immunosorbent Assays. Curr Protoc Immunol. 110, 2.1.1-2.1.23 (2015).

Tags

Keywords: Protein DegradationSaccharomyces CerevisiaeCycloheximide ChaseEndogenous ProteinPlasmid-expressed ProteinOptical DensityMid-logarithmic GrowthHeat BlockStop MixCell LysisProtein Denaturation
check_url/53975?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Buchanan, B. W., Lloyd, M. E., Engle, S. M., Rubenstein, E. M. Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (110), e53975, doi:10.3791/53975 (2016).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image