ダブル蛍光を組み合わせます<em>その場で</em>マウス脳切片の3遺伝子の発現を検出するための免疫標識とのハイブリダイゼーション
Summary
Localizing gene expression to specific cell types can be challenging due to the lack of specific antibodies. Here we describe a protocol for simultaneous triple detection of gene expression by combining double fluorescence RNA in situ hybridization with immunostaining.
Abstract
脳細胞の異なるタイプ、例えば、ニューロン、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、オリゴデンドロサイト前駆体およびミクログリアにおける遺伝子発現の検出は、免疫染色のために特異的な一次または二次抗体の不足によって妨げられることができます。ここでは、第三の遺伝子によってコードされるタンパク質に対する高い特異性の抗体を用いて免疫染色に続いて2遺伝子特異的プローブを用いたin situハイブリダイゼーション二重蛍光を使用して、同じ脳切片における三つの異なる遺伝子の発現を検出するためのプロトコルを説明します。 Aspartoacyclase（ASPA）遺伝子の突然変異は稀な人間白質疾患につながることができます-カナバン病は-オリゴデンドロサイトとミクログリアではなく、星状細胞およびニューロンにおいて発現されると考えられています。しかし、脳内ASPAの正確な発現パターンは、まだ確立されていません。このプロトコルは、ASPAは、成熟オリゴデンドロサイトaのサブセットに発現していることを決定することができましたNDは、一般に、遺伝子発現パターンの研究に広く適用することができます。
Introduction
中枢神経系（CNS）において最も豊富な細胞であるグリア細胞は、希突起膠細胞（CNSのミエリン形成細胞）、オリゴデンドロサイト前駆体（以下、「NG2細胞」としても知られているオプス）、アストロサイト及びミクログリアを含みます。グリア細胞と神経疾患1におけるそれらの潜在的な役割の機能への関心の高まりがあります。例えば、カナバン病（CD）は、年齢2,3の10年前に、通常は死に至る、海綿状白質ジストロフィーとニューロンの進行性の喪失と乳児期早期での出発遺伝性神経変性疾患です。大幅CDにASPAアクティビティ4を減少につながるAspartoacyclase（ASPA）遺伝子の変異が同定されています。 ASPAは、酢酸およびアスパラギン酸5-7を生成し 、N-アセチルアスパラギン酸（NAA）の脱アセチル化を触媒する酵素で、非常に脳に集中する分子です。多くのCD患者起因ASPA ACの欠如にNAAのより高いレベルを示しますtivity。いくつかの研究は、NAA由来の酢酸は、開発やCD 3,5,6を破壊するNAAの故障による開発中に減少ミエリン合成に起因する時の脳内の脂肪酸/脂質の主要な供給源であり得ることが推測しています。
ASPAは、主に脳の腎臓、肝臓および白質で発見され、そしてCDで南極特別保護地区の重要な役割を与えられた、脳におけるこの酵素の細胞発現は、いくつかの研究室によって研究されてきました。脳内ASPA酵素活性を調べることによって、以前の研究では、脳の発達の間ASPA活性の増加は、髄鞘形成8-10の時間経過に匹敵することを見出しました。細胞レベルでは、酵素活性のためだけでなく、in situハイブリダイゼーション（ISH）および免疫組織化学（IHC） でのアッセイは、ASPAは、主に脳内のオリゴデンドロサイトではなく、ニューロンやアストロサイト11月16日に発現していることを示唆している分析します。 ASPAはまたかもしれないことがわかった少数の研究CNS 12,14にミクログリアで発現させること。 OPでASPA発現に対するこれまでのデータは限られています。ニューロン、アストロサイト、OPは、新たに形成されたオリゴデンドロサイト、ミエリンオリゴデンドロサイト、ミクログリア、内皮細胞、および周皮細胞などのマウス大脳皮質における異なる種類の細胞のトランスクリプトームは、RNAの塩基配列決定17で分析した最近の研究によると、 南極特別保護地区はもっぱらオリゴデンドロサイトに発現しています、特にオリゴデンドロサイトのミエリン中（http://web.stanford.edu/group/barres_lab/brain_rnaseq.html）。脳内のASPA発現パターンに、これらの研究にもかかわらず、不確定要素の数が残っています。
別の技術は、遺伝子発現パターンを研究するために使用することができます。 IHCは、組織切片における遺伝子発現の機能的産物（ すなわち、タンパク質）を検出するために一般的に使用される方法です。そのアプリケーションおよび特異性は、対象トンであるため、その大きな有用性にもかかわらず、この手法には限界があります必要な抗体の利用可能性と特異O。比較により、ISHは、mRNAレベルでの任意の遺伝子の発現を明らかにすることができるという利点を有します。しかしながら、特定の細胞型への遺伝子の発現を局在化するために、同時に複数のプローブを使用することは技術的に困難であることができます。この記事では、我々は、タンパク質の蛍光免疫標識とin situハイブリダイゼーション二重蛍光RNAを合成するプロトコルを記述します。我々は、マウス脳におけるアスパの発現パターンを調べるために、技術のこのセットを使用しています。この方法は、共焦点顕微鏡を用いた遺伝子発現の正確な研究を可能にします。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは、免疫染色に続いてin situハイブリダイゼーション二重RNAのためのステップバイステップの手順を提供します。我々は、 アスパは、いくつかの脳の領域で成熟したオリゴデンドロサイトに発現していることを確認するために、このプロトコルを使用しています。
この多段階の手順は、感度に影響を与えることができ、避けるべきである多く…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Work in the authors’ laboratories was supported by the UK Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BB/J006602/1 and BB/L003236/1), the Wellcome Trust (WT100269MA) and the European Research Council (ERC, “Ideas” Programme 293544). SJ was supported by an EMBO long-term fellowship. The authors thank Stephen Grant for his technical assistance.
Materials
| QIAprep® Miniprep | Qiagen | 27104 | |
| Deionized formamide | Sigma | F9037 | for ISH blocking buffer |
| Sodium chloride | Sigma | S3014 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | |
| Hydrochloric acid | VWR International | 20252.290 | |
| Sodium phosphate monobasic anhydrous | Sigma | S8282 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate | Sigma | 30435 | |
| Yeast tRNA | Roche | 10109495001 | |
| 50x Denhardt's solution | Life Technologies | 750018 | |
| Dextran sulfate | Sigma | D8906 | |
| Aspa cDNA clone | Source Bioscience | IRAVp968C0654D | |
| SalI | New England Biolabs | R0138 | |
| Sodium acetate | Sigma | S2889 | |
| Equilibrated phenol | Sigma | P4557 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| Isoamyl alcohol | Aldrich | 496200 | |
| Ethanol | VWR International | 20821.321 | |
| T7 RNA polymerase | Promega | P4074 | |
| Transcription buffer | Promega | P118B | |
| 100mM DTT | Promega | P117B | |
| UTP-DIG NTP mix | Roche | 11277073910 | |
| Rnasin | Promega | N251B | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Filter paper | Fisher scientific | 005479470 | |
| Sucrose | Sigma | 59378 | |
| Diethyl pyrocarbonate | Sigma | D5758 | |
| Pentobarbitone | Animalcare Ltd | BN43054 | |
| Dissecting scissors | World Precision Instruments | 15922 | |
| 25 gauge needle | Terumo | 300600 | |
| Peristaltic pump | Cole-Parmer Instrument Co. Ltd | WZ-07522-30 | |
| Iris scissors | Weiss | 103227 | |
| No.2 tweezers | World Precision Instruments | 500230 | |
| Coronal Brain Matrix | World Precision Instruments | RBMS-200C | |
| Razor blade | Personna Medical | PERS60-0138 | |
| OCT medium | Tissue tek | 4583 | |
| Cryostat/microtome | Bright | ||
| Superfrost plus slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
| Sodium citrate | Sigma | S4641 | for 65°C wash buffer |
| Formamide | Sigma-Aldrich | F7503 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Coverslips | VWR International | 631-0146 | |
| Coplin Jar | Smith Scientific Ltd | 2959 | |
| Blocking reagent | Roche | 11096176001 | |
| Heat-inactivated sheep serum | Sigma | S2263 | |
| Hydrophobic pen | Cosmo Bio | DAI-PAP-S | 1:500 |
| α-FITC POD-conjugated antibody | Roche | 11426346910 | |
| TSA™ Plus Fluorescein System | Perkin Elmer | NEL741001KT | 1:1500 |
| α-DIG AP-conjugated | Roche | 11093274910 | |
| Fast red tablets | Roche | 11496549001 | |
| .22µM filter | Millex | SLGP033RS | |
| α-Olig2 Rabbit antbody | Millipore | AB9610 | |
| Alexa Fluor® 647-conjugated α-rabbit antibody | Life technologies | A-31573 | 1:1000 |
| bisBenzimide H 33258 | sigma | B2883 | |
| Mounting medium | Dako | S3023 | |
| Leica SP2 confocal microscope | Leica |
References
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