Abstract
Эмбриональное развитие представляет собой многоступенчатый процесс, включающий активацию и подавление многих генов. Enhancer элементов в геноме, как известно, способствуют ткани и клеточного типа специфической регуляции экспрессии генов во время дифференцировки клеток. Таким образом, их идентификация и дальнейшее исследование имеет важное значение для того, чтобы понять, как определяется судьба клеток. Интеграция данных экспрессии генов (например, микрочипов или РНК-Seq) и результаты иммунопреципитации хроматина (CHIP) основанное геномные исследования (ЧИП-сл) позволяет крупномасштабную идентификацию этих регуляторных областей. Тем не менее, функциональная проверка конкретных усилителей камерного типа требует дальнейшего в пробирке и в естественных условиях экспериментальных процедур. Здесь мы опишем, как активные усилители могут быть идентифицированы и экспериментально подтверждено. Этот протокол обеспечивает рабочий процесс шаг за шагом, который включает в себя: 1) идентификация регуляторных областей путем анализа, 2) Клонирование и EXPER Обломок-сл данныхментальные проверка предполагаемого регуляторного потенциала выявленных геномных последовательностей в анализе репортерного, и 3) определение активности энхансера в естественных условиях путем измерения уровня транскриптов РНК энхансер. Представленный протокол достаточно подробным, чтобы помочь любому, чтобы настроить этот рабочий процесс в лаборатории. Важно отметить, что протокол может быть легко адаптирован к и в любой системе клеточной модели.
Protocol
1. Enhancer Отбор на основе чип-анализа сл
- Скачать RXR ЧИП-Seq сырые fastq данные файла (mm_ES_RXR_24h_ATRA.fastq.gz) от http://ngsdebftp.med.unideb.hu/bioinformatics/
- Загрузка и извлечение требуемого файла индекса BWA для выравнивания (в нашем случае: Mus_musculus_UCSC_mm10).(ftp://igenome:G3nom3s4u@ussd-ftp.illumina.com/Mus_musculus/UCSC/mm10/Mus_musculus_UCSC_mm10.tar.gz
ПРИМЕЧАНИЕ: Посещение https://github.com/ahorvath/Bioinformatics_scripts для получения дополнительной информации относительно этапы анализа биоинформатики и загружать скрипты, используемые ниже. - Совместите файл примера fastq к MM10 генома (использовать сценарий: perform_alignment.sh). Это позволит создать папку с файлом .bam и статистики выравнивания. Унифицированные RXR Обломок-сл данных (mm_ES_RXR_24h_ATRA.bam), а соответствующий индекс файла (.bai) доступны здесь:
http://ngsdebftp.med.unideb.hu/bioinformatics/
Примечание: BWA представляет собой программный пакет, который выравнивает Релательно короткие последовательности (например, чиповых-сл результаты) в базе данных последовательностей, таких как опорной мыши генома (например, MM10) 13. - Запустить скрипт (callpeaks.sh) для пика вызова и де Novo анализа мотива. Используйте файл .bam в качестве входных данных. Сценарий основан на Homer findPeaks 14.
ПРИМЕЧАНИЕ: Выходные файлы дают нам информацию об общем количестве пиков, обогащение мотивов, процент фона и целевых последовательностей с мотивами, и т.д.. (Рисунок 1). Как правило, несколько мотивов перечислены в порядке их значимости. - Переназначение # 1 место мотив (NR половина `AGGTCA`) (используйте скрипт: remap_motif.sh)
Примечание: В результате, скрипт генерирует .bed файл, который показывает, какие Обломок-пики охватывают геномные области, которые содержат канонический участок связывания фактора транскрипции, представляющего интерес. - Скачать и визуализировать результаты выровненной RXR Обломок-SEQ читает (mm_ES_RXR_24h_ATRA.bam (также скачать .bai)) и AGGTCA мотив вхождения (mm_ES_RXR_24h_ATRA_homerpeaks_motif1_mm10s_200_remaped_mbed.bed) по интегративной геномики Viewer (ВНА) 15 , чтобы определить предполагаемую RAR / RXR сайты связывания (Рисунок 2 и Рисунок 3).
Примечание: Интеграция различных Обломок-сл данных позволит более точно прогнозировать хорошие усиливающие 16,17 кандидата. Недавние исследования показали , что активные усиливающие , как правило , обогащены P300 и коррелируют с H3K4me1 и H3K27ac, и расположены в открытых хроматина регионах, тем самым показывая гиперчувствительность ДНКазы I также рекомендуется 18-21. - Используйте "Определить интересующую область" в ВНА 15 , чтобы получить 200 - 400 последовательности пар оснований выбранной области генома и использовать эти последовательности для последующих конструкций праймеров.
2. Анализ Репортер
Примечание: Система люциферин / люциферазы используетсякак очень чувствительного анализа репортера для регуляции транскрипции. В зависимости от активности люциферазы энхансер фермент, который катализирует окисление люциферин до оксилюциферин что приводит к bioluminescense, который может быть обнаружен. В качестве первого шага, идентифицированы предполагаемые последовательности энхансеров должны быть субклонируют в вектор - репортера (например, ТК-люциферазы 22, pGL3 или NanoLuc).
- Праймер Дизайн
- Дизайн ПЦР - праймеров для амплификации 200 - 400 пар оснований предполагаемых областей усиливающих по Primer3 (доступны здесь: http://bioinfo.ut.ee/primer3/) 23
- Скопируйте и вставьте геномную последовательность из ВНА, которая включает предполагаемую сайт связывания в Primer3 (см шаг 1.7). Установить диапазон размеров продукта до 250 - 300 пар оснований в Primer3.
- Сверяет ПЦР - праймеров с помощью браузера УСК генома Виртуальная ПЦР инструмент (https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr) 24
Примечание: Этот протокол на более позднем этапе использует HindIIЯ и BamHI ферменты рестрикции для клонирования. Проверьте , правильно ли ПЦР - амплификации последовательности , как предсказывается УСК In-силикомарганца ПЦР инструмент будет содержать сайты рестрикции AAGCTT или GGATCC (например, http://nc2.neb.com/NEBcutter2/). - Получение необходимых праймеров от коммерческого поставщика.
- ПЦР - амплификации Enhancer последовательности из геномной ДНК
- Очищают шаблон геномной ДНК из первичных клеток (например, первичные эмбриональные фибробласты). Использование коммерческого набора для GDNA изоляции и следовать инструкциям производителя.
Примечание: Высокое качество гДНК имеет важное значение для успешной ПЦР-амплификации. Соответствующие ВАС-клонов могут быть использованы, если ПЦР не легко из гДНК. - Готовят 50 мкл ПЦР - реакционной смеси , содержащей 100 нг гДНК, 5 мкл 10х буфера, 3 мкл MgSO 4 (25 мМ), 5 мкл дНТФ (2 мМ каждого), 1,5 мкл Fwd праймера (10 мкМ), 1,5 мкл Rev праймера (10 мкМ) , 1 мкл ДНК-полимеразы
- Установите цикл ПЦР (2 мин 95 ° C, (20 сек 95 ° С, 10 сек 58 - 65 ° С, 18 сек 70 ° С) X25 повтор, 2 мин 70 ° С, навсегда 4 ° С). Установка температуры отжига с учетом грунтовку предсказал значения Tm.
- Очищают продукт ПЦР с использованием набора для очистки коммерческой ПЦР и следовать инструкциям производителя.
- Введем сайты рестрикции для клонирования путем повторения ПЦР с праймерами , как он использован выше, но с добавлением свесов на их 5' - концах (например, Fwd: 5'-ATAT AAGCTT xxxxxxxxxxxxxxxxxxxx-3 '(HindIII), Rev: 5'-ТАТА GGATCC xxxxxxxxxxxxxxxxxxxx -3 '(BamHI)).
- Выполните 5 мкл продукта ПЦР на агарозном геле, чтобы проверить наличие неспецифических продуктов ПЦР.
Примечание: Если больше групп обнаружены, запустить весь ПЦР-продукт и очищают соответствующую группу с помощью набора для экстракции геля коммерческого. - ограничение
Примечание: Для клонирования вставки перед ТК промотора 22 очищенного продукта ПЦР и вектор (например, TK-Luc) должны быть расщепляли HindIII и BamHI.- Готовят 50 мкл реакционной смеси, содержащей 1 мкг очищенного продукта ПЦР, 1 мкл HindIII (20 ед / мкл) 1 мкл BamHI (20 ед / мкл) и 5 мкл 10х буфера.
- Подготовить 250 мкл реакционной смеси, содержащей вектор 5 мкг (TK Luc, или альтернативный вектор-репортер), 5 мкл HindIII (20 ед / мкл), 5 мкл BamHI (20 ед / мкл), 5 мкл термочувствительный щелочной фосфатазы (1 ед / мкл) и 25 мкл 10х буфера.
Примечание: AP обработка вектора значительно уменьшает самолигирование одностенных расщепленного вектора и, таким образом фон. - Выдержите реакционных смесей в течение 4 ч при температуре 37 ° С, а затем очищают переваренных продуктов ПЦР и вектор с использованием набора для очистки ПЦР-коммерческой.
- LigatioN
- Настройка реакции на перевязки в ПЦР-пробирки, включая 2 мкл 10х Т4 ДНК-лигазы буфера, 10 нг TK-Luc вектор, 50 нг вставки (переваривается продукт ПЦР), 1 мкл Т4 ДНК-лигазы (400 ед / мкл) и нуклеазы без воды до 20 мкл.
Примечание: Приготовьте отрицательный контроль, когда реакция не содержит вставку. - Аккуратно перемешайте реакцию с помощью пипетки вверх и вниз, спином вниз кратко пробирки для ПЦР с использованием мини-центрифугу, а затем инкубируют при комнатной температуре в течение 10 мин.
- Тепло инактивируют при 65 ° С в течение 10 мин , затем охладить на льду и использовать 5 мкл продукта для превращения в 50 мкл компетентных клеток (например, DH5 & alpha).
- Используйте стандартную процедуру теплового шока для трансформации бактерий, подобрать колоний и выделения плазмидной ДНК с коммерческим набором. Проверка все конструкции путем секвенирования до следующих шагов.
- Настройка реакции на перевязки в ПЦР-пробирки, включая 2 мкл 10х Т4 ДНК-лигазы буфера, 10 нг TK-Luc вектор, 50 нг вставки (переваривается продукт ПЦР), 1 мкл Т4 ДНК-лигазы (400 ед / мкл) и нуклеазы без воды до 20 мкл.
- Трансфекция клеток ES
- С помощью 48-луночных планшетах. Добавить 200 мкл 0,1% желатина Solutион / лунку за 30 мин до клеточной обшивки.
- Пластинчатые эмбриональных стволовых (ЭС) клеток в день до трансфекции. Используйте фидерных свободных ES клеток и планшет при плотности 3 × 10 4 клеток на лунку в 250 мкл ES СМИ / лунку.
- Подготовьте плазмиды смеси (каждая смесь рассчитана на 8 лунок, 4 необработанной и 4 - ретиноевой кислоты лечение) Смешайте 1:. 1 250 нг TK-Luc Пустой (отрицательный контроль), 950 нг кодирования вектор β-галактозидазы (βGal), Mix 2 : 1250 нг TK-Luc Hoxa1 энхансер (положительный контроль), 950 нг βGal, Микс 3: 1,250 нг TK-Luc PRMT8 энхансер (область интереса), 950 нг βGal.
Примечание: ES-клетки экспрессируют желательные факторы транскрипции (RAR / RXR). Оставьте скважины нетрансфецированные для определения значений базовых позже во время измерений люциферазы и β-галактозидазы. - Добавить качество трансфекция уменьшенные сыворотки средства массовой информации для каждой плазмиды смешивают до 106 мкл общего объема (достаточно для 8 лунок).
- Добавить 4,5 мкл качества ES трансфекциюионный реагент затем тщательно перемешать с помощью пипетки 15 раз вверх и вниз. Выдержите трансфекции смесь в течение 10 мин при комнатной температуре.
- Добавьте 13 мкл трансфекции смеси к клеткам на лунку, тщательно перемешать с помощью пипетки. Поместите клетки обратно в инкубатор (37 ° C) O / N до лечения лигандом.
- Осторожно удалите носитель путем аспирации из клеток и добавить 250 мкл свежей информации / лунку, содержащую 0,01 - 1 мкМ все-транс-ретиноевой кислоты (RA) в качестве конечной концентрации или ДМСО в качестве транспортного средства. Инкубируйте клетки в течение 24 - 48 часов.
Примечание: ретиноевой кислоты чувствителен к свету.
- Получение клеточных лизатов
- Развести 5x буфера для лизиса (1,25 мл 0,5 М Трис , рН = 7,8, 1 мл 1 М дитиотреитола (ДТТ) (в H 2 O), 10 мл 0,1 М ЭДТА , рН = 8,0, 50 мл глицерина, 5 мл Тритона Х-100, стерильные вода до 100 мл) до 1 раза с использованием стерильной воды, добавить 20 мкл 1М DTT / 10 мл и уравновешиваться до комнатной температуры перед использованием. Приготовьте 10 мл в течение 48-луночного планшета на день анализа. Удалить СМИ тщательно аспирации из клеток. Промойте клетки один раз с 1x PBS. Добавить 200 мкл 1х буфера для лизиса / лунку непосредственно к клеткам.
- Встряхивают в течение 2 ч при комнатной температуре (химический лизиса). Замораживание клеточных лизатов на пластине при температуре -80 ° C (механический лизис). Лизаты можно хранить при температуре -80 ° С в течение нескольких дней.
- Оттепель лизатов. После полного оттаивания, передача лизаты клеток на 96-луночный планшет с использованием электронного многоканальную пипетку. Передача 80 мкл лизата клеток в 96-луночного четкой пластины для β-галактозидазы анализа и 40 мкл лизата клеток в белой тарелке для измерения люциферазы. Избегайте образования пузырьков.
- β-галактозидазы пробирного
Примечание: Бета-галактозидазы или альтернативные вторые репортеры должны быть использованы в качестве внутреннего контроля для учета неспецифических экспериментальных вариаций.- Готовят буфер субстрата β-галактозидазы: 80,0 г Na 2 HPO 4 • 7H 2 O,3,8 г NaH 2 PO 4 • H 2 O, 30,0 г KCl, 1,0 г MgSO 4 • 7H 2 O, составляют до 1000 мл стерильной водой. Регулировка рН до 7,4. Фильтр стерилизовать (0,2 мкм) и хранят при температуре 4 ° С
- Смешайте субстратный буфер 1 мл β-галактозидазы с 4 мг ONPG (о-нитрофенил-бета-D-галактозидазы). Добавить 3,5 мкл 2-меркаптоэтанола (βME) на 1 мл буфера непосредственно перед использованием. Добавьте 100 мкл буфера для субстрата β-галактозидазы до 80 мкл лизата клеток.
- Инкубируйте реакции при 37 ° С до тех пор, слабый желтый цвет не будет разработан. Измерить оптическую плотность при OD 420 нм на планшет-ридер и экспорт данных.
Примечание: Время изменяется в зависимости от эффективности трансфекции, как правило, не дольше, чем 30 мин.
- анализа люциферазы
- Приготовьте 50 мл люциферин субстрат реагента: 15,1 мг D-люциферин соли, 82,7 мг АТФ соль, 185 мг MgSO 4 • 7H 2 O, добавляют 50 мл полипропиленовую трубку,затем добавляют 1,5 мл 1 М HEPES буфера, 48,5 мл АТФ свободной воды, вихрь, убедитесь, что все соединения полностью растворяются. Хранить 5 - 10 мл аликвоты при -80 ° С.
- Теплый 5 мл люциферин субстрат реагента до комнатной температуры перед началом работы. Пипетка 100 мкл субстрата реагента в каждую лунку белой пластины, содержащей 40 мкл лизата клеток и измерять сигнал сразу с помощью люминесцентного счетчика машины.
- Получите деятельность, по крайней мере, трех независимых экспериментов в трех экземплярах трансфекциях.
- Вычислить первую базовую нормализованное активность люциферазы и базовые нормированные значения β-галактозидазы для каждой скважины путем вычитания средних значений, измеренных для не трансфицированных клеток из каждого измеренного значения. Затем вычислить отношение люциферазы / бета-галактозидазы.
3. Характеристика РНК Enhancer
Примечание: Более прямой индикатор активности энхансера возникла из недавнего генома-Wисследования язь, определившие много коротких некодирующих РНК, размером от 50 до 2000 нт, которые были расшифрованы с усилителями, и называются усиливающие РНК (eRNAs) 16,25,26 (рисунок 4). Эрна индукция сильно коррелирует с индукцией соседних экзонов-кодирующих генов. Таким образом, энхансер активность сигнал-зависимого может быть определена количественно в естественных условиях путем сравнения производства Эрна между различными условиями РТ-КПЦР.
- Рекомендации по Primer дизайн для обнаружения Эрна по RT-КПЦР
- Выберите геномные области для измерений Эрна, что по крайней мере 1,5 - 2 кб от аннотированных стартовых сайтов транскрипции.
Примечание: Важно отметить, что высокие уровни транскрипции мРНК через внутригенных усилителями предотвратить точное определение количества Эрной в смысловой ориентации, антисмысловые eRNAs на внутригенных усилителями могут быть обнаружены и похожи на уровне до eRNAs на extragenic усилителями. - Как правило, используют регионы 200 - 1000 пар оснований сюдам от центра фактора транскрипции сайта связывания интерес для разработки праймера либо на смысловой или анти-смысловой цепи (рисунок 4 и рисунок 6).
Примечание: Если GRO-сл, ДНКазы-сл, H3K4me1, H3K4me3 или H3K27ac ЧИП-SEQ данные доступны от желаемых типов клеток и условий, он может быть использован для более точного дизайна грунтовки. eRNAs транскрибируются с предполагаемыми областей усиливающих, характеризующихся высокими уровнями H3K4me1 и ME3. Выражение eRNAs положительно коррелирует с обогащением активированного энхансер гистонов марки H3K27ac. - Дизайн ПЦР - праймеры для флуоресцентного красителя на основе измерения RT-КПЦР из eRNAs по Primer3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3/) 23 Сформировать последовательность антисмысловой (обратный комплемент смысловой цепи) для дизайна грунтовки в соответствии с : http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html. Вставка 200 - 300 п.н. смысловой или антисмысловой последовательности для дизайна праймеров.
- Выберите геномные области для измерений Эрна, что по крайней мере 1,5 - 2 кб от аннотированных стартовых сайтов транскрипции.
- Измерение Эрна Транскрипция
- Изолировать тотальной РНК из обработанных клеток с коммерческими кислой фенольной реагентом экстракции / хлороформ основе в соответствии с рекомендациями завода-изготовителя.
- Используйте DNAseI для лечения изолированной РНК перед использованием их в реакции обратной транскрипции. Деактивированы ДНКазы в соответствии с рекомендациями изготовителя перед обратной транскрипции.
- Измерение концентрации РНК после лечения ДНКазы I и использовать 1000 нг на реакцию RT. Использование высокого качества обратной транскриптазы.
Примечание: В большое количество eRNAs не может быть Полиаденилированная, обратной транскрипции требует использования случайных праймеров. - Обнаружение обратной транскрипции Эрна с помощью RT-КПЦР с использованием стандартной процедуры. Мера , не зависящих от лечения мРНК для нормализации (например, 36B4, Ppia, GAPDH, Actb).
- Очищают шаблон геномной ДНК из первичных клеток (например, первичные эмбриональные фибробласты). Использование коммерческого набора для GDNA изоляции и следовать инструкциям производителя.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мы использовали пан-специфическое антитело RXR с целью выявления генома, какие гены RA-регулируемых имеют обогащение рецепторов в их непосредственной близости. Анализ биоинформатики RXR Обломок-сл данных , полученных из клеток ES , обработанных ретиноевой кислотой выявлено обогащение половины участка ядерных рецепторов (AGGTCA) под RXR занятых узлов (рисунок 1). Используя алгоритм биоинформатики мы нанесем назад результат поиска мотив для половины участка к RXR ЧИП-Seq данных (Рисунок 2). Этот анализ помог нам точно определить те пики, которые были ChIP перекрывающихся с каноническими сайтами связывания ядерных рецепторов. Визуализация этих сайтов в ВНА показали обогащение этих факторов транскрипции в непосредственной близости от Hoxa1, ранее характеризующейся цели RAR / RXR (рисунок 2 и рисунок 3). Мы также идентифицировали ген - мишень новым RA, а именно PRMT8 27. Это лаолучатель область содержит прямой повтор без каких - либо распорных нуклеотидов между двух половин сайтов (AGGTCAAGGTCA) (рисунок 3). Для того, чтобы функционально проверить, что элемент идентифицирован для Hoxa1 действительно может связать RAR / RXR и регламентированы РА мы построили ТК-люциферазы векторов репортер, которые содержали ~ 300bp геномную область, в том числе выявленных элементов. Мы также построены векторы без элемента ответа (рисунок 5). ЭС клетки были трансфицированы и активность люциферазы измеряли в отсутствие и в присутствии ретиноевой кислоты (рис 5). Конструкты, содержащие элемент ретиноевой кислоты ответ (редком) сделал показать интенсивность сигнала увеличилась люциферазы при обработке РА, в то время как конструкция без RARE не индуцируемым.
Мы также изучали кислотно-зависимой активности ретиноевой Hoxa1 энхансер. Для того, чтобы установить, является ли Эрна выражение чувства и анти-смысл Hoxa1 RAR / RXR-связанного энхансер Correlate с экспрессии мРНК гена, мы также измеряли уровень мРНК Hoxa1 (рисунок 6). Эти результаты подтвердили, что усиливающий активность индуцируется кратковременного лечения РА (3 ч), тем самым подтверждая, что энхансер, вероятно, участвует в регуляции энхансера RA-зависимой.
Рисунок 1. Гомер Д Е Novo Motif Результаты. Выходной HTML (homerResults.html) , порожденную Гомера на примере RXR ЧИП-сл показан. Последовательность логотипы , соответствующие началу обогащенные фактор транскрипции мотивы , идентифицированные де Novo открытия мотив в RXR-связанного локусов. 7463 RXR заняты геномные области были использованы для поиска мотива. 77,66% из этих областей содержит AGGTCA-подобный мотив (причислены # 1). Для более подробного описания визита: (http://homer.salk.edu/ho Мер / мотив /) Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Нахождение геномные области , содержащие мотив интереса. Визуализация выровненной RXR Обломок-SEQ чтений (mm_ES_RXR_24h_ATRA.bam и AGGTCA мотив вхождения (mm_ES_RXR_24h_ATRA_homerpeaks_motif1_mm10s_200_remaped_mbed.bed) по интегративной геномики Viewer (IGV). Ряды окрашено чтения нити (чтений на + цепи: красный, - прядей:. синий) Геном используется для выравнивания: MM10. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
JPG "/>
Рисунок 3. Геномные локусы Hoxa1 и PRMT8 энхансеры. ВНА снимок RXR ЧИП-Seq сигналов , полученных из необработанных и обработанных RA (24 часа в сутки, 1 мкМ) эмбриональных стволовых клеток 27 показаны. Выявленные последовательности связывания окрашены в красный цвет. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
. Рисунок 4. Экспериментальный дизайн для тестирования Эрна кодирующих последовательностей Расширители , выбранные для энхансер РНК (Erna) измерения должны быть расположены не менее 1,5 - 2 килобайта расстояние относительно сайта инициации транскрипции (TSS) от ближайшего гена. Обломок-ПОСЛ данные фактора транскрипции (TF), представляющие интерес и анализа мотив может быть использован для идентификации прямого связывания участков генома. Как связывание transcripных коактиватор (например, P300) часто отмечает дистальные энхансеры, области , обогащенные и для TF и P300 являются хорошими кандидатами Enhancer. Выражение eRNAs положительно коррелирует с обогащением активированного энхансер гистонов марки H3K27ac. Регионы 200 -. 1000 п.н. прочь в смысле или направлении антисмысловой от центра фактора транскрипции связывания рекомендуется для дизайна Эрна грунтовки Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5. активность люциферазы Показанное Reporter Создаёт в ES клетках. Выявленные геномные области энхансера Hoxa1 были клонированы в ТК-Luc вектора и трансфицировали в эмбриональные стволовые клетки. Построить 1 и 2 содержали элемент ответа кислоты ретиноевой (RARE, ипподчеркнутая последовательность). Клетки обрабатывали RA (24 ч, 1 мкМ). βGal был использован в качестве внутреннего контроля для нормализации. Полосы представляют средние нормированные значения из четырех биологических повторностях. ± с.о. *** P <0,005 Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 6. Уровни ретиноевой кислоты Индуцированные Enhancer РНК Транскрипция. Hoxa1 мРНК и Эрна как измерено с помощью RT-КПЦР. Общую РНК выделяли из ЭС клеток, обработанных в течение 3 ч с ретиноевой кислотой (RA) или ДМСО в качестве носителя (VEH). Праймеры для смысловой и антисмысловой обнаружения Эрна и ампликонов PCR показаны. Расстояние областей, обнаруженных Эрна RT-КПЦР от центра участка связывания RXR указывается. Значения были нормализованы к среднему значению 36B4 мРNA. Данные представляют среднее ± стандартная ошибка *** Р <0,005 Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| KOD DNA polymerase | Merck Millipore | 71085-3 | for PCR amplification of enhancer from gDNA |
| DNeasy Blood & Tissue kit | Qiagen | 69504 | for genomic DNA isolation |
| QIAquick PCR Purification kit | Qiagen | 28106 | for PCR product purification |
| Gel extraction kit | Qiagen | 28706 | for gel extraction if there are more PCR product |
| HindIII | NEB | R3104L | restriction enzyme |
| BamHI | NEB | R3136L | restriction enzyme |
| FastAP | Thermo Scientific | EF0651 | release of 5'- and 3'-phosphate groups from DNA |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202 | for ligation |
| QIAprep Spin Miniprep kit | Qiagen | 27106 | for plasmid isolation |
| DMEM | Gibco | 31966-021 | ES media |
| FBS | Hyclone | SH30070.03 | ES media |
| MEM Non-Essential Amino Acid | Sigma | M7145 | ES media |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma | P4333 | ES media |
| Beta Mercaptoethanol | Sigma | M6250 | ES media |
| FuGENE HD | Promega | E2311 | transfection reagent |
| Opti-MEM® I Reduced Serum Medium | Life Technologies | 31985-062 | for transfection |
| All-trans retinoic acid | Sigma | R2625 | ligand, for activation of RAR/RXR |
| 96-well clear plate | Greiner | 655101 | for Beta galactosidase assay |
| 96-well white plate | Greiner | 655075 | for Luciferase assay |
| D-luciferin, potassium salt | Goldbio.com | 115144-35-9 | for Luciferase assay |
| ATP salt | Sigma | A7699-1G | for Luciferase assay |
| MgSO4•7H2O | Sigma | 230391-25G | for Luciferase assay |
| HEPES | Sigma | H3375-25G | for Luciferase assay |
| Na2HPO4 •7H2O | Sigma | 431478-50G | for Beta galactosidase assay |
| NaH2PO4 •H2O | Sigma | S9638-25G | for Beta galactosidase assay |
| MgSO4•7H2O | Sigma | 230391-25G | for Beta galactosidase assay |
| KCl | Sigma | P9541-500G | for Beta galactosidase assay |
| ONPG (o-nitrophenyl-β-D-galactosidase) | Sigma | N1127-1G | for Beta galactosidase assay |
| TRIzol® | Life Technologies | 15596-026 | RNA isolation |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Life Technologies | 4368814 | reverse transcription of eRNA |
| Rnase-free Dnase | Promega | M6101 | Dnase treatment |
| SsoFast Eva Green | BioRad | 750000105 | RT-qPCR mastermix |
| CFX384 Touch™ Real-Time PCR Detection System | BioRad | qPCR machine | |
| BioTek Synergy 4 microplate reader | BioTek | luminescent counter |
References
- Wamstad, J. A., Wang, X., Demuren, O. O., Boyer, L. A. Distal enhancers: new insights into heart development and disease. Trends in cell biology. 24, 294-302 (2014).
- Pennacchio, L. A., Bickmore, W., Dean, A., Nobrega, M. A., Bejerano, G.
- Mardis, E. R. ChIP-seq: welcome to the new frontier. Nature methods. 4, 613-614 (2007).
- Muller, F., Tora, L. Chromatin and DNA sequences in defining promoters for transcription initiation. Biochim Biophys Acta. 1839, 118-128 (2013).
- Ounzain, S., Pedrazzini, T. The promise of enhancer-associated long noncoding RNAs in cardiac regeneration. Trends Cardiovasc Med. , (2015).
- Lam, M. T., Li, W., Rosenfeld, M. G., Glass, C. K. Enhancer RNAs and regulated transcriptional programs. Trends Biochem Sci. 39, 170-182 (2014).
- Dickel, D. E., et al. Function-based identification of mammalian enhancers using site-specific integration. Nature methods. 11, 566-571 (2014).
- Blum, R., Vethantham, V., Bowman, C., Rudnicki, M., Dynlacht, B. D. Genome-wide identification of enhancers in skeletal muscle: the role of MyoD1. Genes Dev. 26, 2763-2779 (2012).
- Vermunt, M. W., et al. Large-scale identification of coregulated enhancer networks in the adult human brain. Cell reports 9. , 767-779 (2014).
- Bain, G., Kitchens, D., Yao, M., Huettner, J. E., Gottlieb, D. I. Embryonic stem cells express neuronal properties in vitro. Dev Biol. 168, 342-357 (1995).
- Mahony, S., et al. Ligand-dependent dynamics of retinoic acid receptor binding during early neurogenesis. Genome Biol. 12 (R2), (2011).
- Simandi, Z., Balint, B. L., Poliska, S., Ruhl, R., Nagy, L. Activation of retinoic acid receptor signaling coordinates lineage commitment of spontaneously differentiating mouse embryonic stem cells in embryoid bodies. FEBS Lett. 584, 3123-3130 (2010).
- Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 25, 1754-1760 (2009).
- Heinz, S., et al. Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities. Mol Cell. 38, 576-589 (2010).
- Robinson, J. T., et al.
- Daniel, B., et al. The active enhancer network operated by liganded RXR supports angiogenic activity in macrophages. Genes Dev. 28, 1562-1577 (2013).
- Zhu, Y., et al. Predicting enhancer transcription and activity from chromatin modifications. Nucleic Acids Res. 41, 10032-10043 (2013).
- Visel, A., et al. ChIP-seq accurately predicts tissue-specific activity of enhancers. Nature. 457, 854-858 (2009).
- Heintzman, N. D., et al. Distinct and predictive chromatin signatures of transcriptional promoters and enhancers in the human genome. Nat Genet. 39, 311-318 (2007).
- Rada-Iglesias, A., et al. A unique chromatin signature uncovers early developmental enhancers in humans. Nature. 470, 279-283 (2010).
- Bonn, S., et al. Tissue-specific analysis of chromatin state identifies temporal signatures of enhancer activity during embryonic development. Nat Genet. 44, 148-156 (2012).
- Hollenberg, S. M., Giguere, V., Segui, P., Evans, R. M. Colocalization of DNA-binding and transcriptional activation functions in the human glucocorticoid receptor. Cell. 49, 39-46 (1987).
- Untergasser, A., et al.
- Rhead, B., et al. The UCSC Genome Browser database: update 2010. Nucleic Acids Res. 38, D613-D619 (2010).
- Kim, T. K., et al. Widespread transcription at neuronal activity-regulated enhancers. Nature. 465, 182-187 (2010).
- Wang, D., et al. Reprogramming transcription by distinct classes of enhancers functionally defined by eRNA. Nature. 474, 390-394 (2011).
- Simandi, Z., et al. PRMT1 and PRMT8 regulate retinoic acid-dependent neuronal differentiation with implications to neuropathology. Stem Cells. 33, 726-741 (2014).
- Zhou, H. Y., et al. A Sox2 distal enhancer cluster regulates embryonic stem cell differentiation potential. Genes Dev. 28, 2699-2711 (2014).
