Isolement de cellules de souris coronaire endothéliales
Summary
This protocol is prepared to share our method of isolating mouse coronary endothelial cells for the purpose of imaging or to conduct molecular biological experiments.
Abstract
cellules endothéliales tapissent la paroi interne des vaisseaux sanguins et jouent un rôle important dans la régulation du tonus vasculaire, la perméabilité vasculaire, et la nouvelle formation vasculaire. le dysfonctionnement des cellules endothéliales est impliquée dans le développement et la progression de nombreuses maladies cardiovasculaires, y compris une maladie cardiaque ischémique. Pour examiner la fonction et la caractérisation des cellules endothéliales coronaires, l'isolement des cellules est la première étape et elle nécessite une grande pureté et en quantité pour effectuer des expériences ultérieures. Ce protocole décrit une méthode efficace pour isoler les cellules endothéliales coronaires de souris adulte. Le cœur de la souris est disséquée et hachée en petits morceaux. Après la digestion du coeur en utilisant la dispase II et de la collagénase, les cellules sont lavées et incubées avec des billes magnétiques qui sont conjuguées avec un anticorps anti-CD31. Les billes avec les cellules endothéliales sont lavées plusieurs fois et sont prêts à utiliser dans diverses applications, y compris l'imagerie et de biologie moléculaire experiments. L' isolement efficace donne environ 10 4 cellules par un seul cœur avec plus de 90% de pureté.
Introduction
Des modèles de souris de diverses maladies cardio-vasculaires et des troubles métaboliques portent des changements physiologiques et moléculaires qui sont similaires à celles observées chez les patients. En outre, la modification génétique de la souris est un outil puissant qui nous permet d'étudier le rôle pathogène de gènes spécifiques dans le développement et la progression des maladies. De nos jours, le gène knock-in type de cellule spécifique ou souris -out sont facilement générés dans de nombreux laboratoires et la mesure de l'ARNm et les niveaux de protéines dans des types cellulaires spécifiques est la première étape pour déterminer si les souris ont été vraiment génétiquement modifiées.
Endothélium est une mince couche unique de cellules endothéliales (EC) qui lignées la paroi vasculaire intérieure. Les cellules endothéliales jouent un rôle essentiel dans la régulation de la tension vasculaire, la perméabilité vasculaire, et la nouvelle formation vasculaire 1,2. La dysfonction endothéliale est une caractéristique de nombreuses conditions pathologiques et des changements dans la fonction endothéliale peut conduire à diverses voituremaladies cardio- 3,4. Il est donc important d'étudier la fonction des cellules endothéliales, dans des conditions physiologiques et physiopathologiques.
Il y a plusieurs façons d'isoler CEs 5-8 et la méthode d'isolement doit être optimisée en fonction de quels tissus et les espèces seront utilisées. En effet , CEs provenant de différents tissus présentent un degré élevé d'hétérogénéité par rapport à leurs marqueurs de surface et l' expression des protéines 9. l'isolement réussie des cellules endothéliales peut souvent être difficile et nécessite un certain degré de formation et de pratique. Une fois atteint, le procédé d'isolement proposé dans ce protocole se révèle être stable et efficace.
L'objectif global de cette méthode est d'obtenir la souris CEs coronaire (MCECs) de haute qualité et la quantité. Même si la quantité de cellules recueillies à partir d'un coeur est inférieure à cellules collectées à partir d'autres tissus en utilisant d'autres techniques, cette technique fournit encore pariqualité ter. La pureté des cellules endothéliales dans la population résultante est supérieure à 90%. Ainsi, cette technique serait idéal pour les applications qui reposent sur les cellules endothéliales purement isolées telles que l'imagerie cellulaire.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les cellules endothéliales les plus largement utilisés dans la recherche sont des cellules humaines de la veine ombilicale endothéliales (HUVEC) en raison de leur commodité et la facilité de culture. Cependant, beaucoup de recherches , il faut disposer d'un modèle physiologique atteint par l'isolement des cellules endothéliales provenant d' autres organes spécifiques 10. Les cellules endotheliales forment une population mineure de cellules dans le tissu cardiaque; leur isolement et leur cu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par la subvention du National Institutes of Health (HL115578 à A. Makino).
Materials
| BSA | Sigma | A3311-10G | |
| EDTA | Fisher | BP120-500 | |
| HBSS | Fisher | SH3026801 | |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H4034-500G | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021-1KG | |
| Sheep anti-rat IgG beads | Life Technologies | F-410L | DynaBeads pan mouse IgG , Thermo Fisher Scientific, cat# 11035 |
| Rat anti-mouse PECAM Antibody | BD Pharmigen | 550274 | BD Biosciences |
| IFCS | Fisher | SH30072.04 | |
| M199 | Fisher | MT10060-CV | |
| Dispase (Neutral Protease) | Worthington Biochemical Corp./Fisher | LS02109 | |
| Collagenase Type II | Worthington Biochemical Corp./Fisher | LS004176 | |
| Glycerol | Fisher | BP381-1 | |
| Igepal | Sigma | 13021-50ml | I3021-50 ml |
| Phosphatase inhibitor cocktail | Sigma | P0044-1ml | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | P8340-1 ml | |
| Heparin | Sigma | H3149-100KU | |
| FBS | Fisher/Mediatech | MT35010CV | |
| D-Valine | Sigma | V1255-5G | |
| EGS | BD | 356006 | Corning |
| Penicillin/Streptomycin | Fisher/Mediatech | MT-30-002-Cl | MT-30-002-CI |
References
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