This article provides an in depth guide for the assembly and operation of a structured illumination microscope operating with total internal reflection fluorescence illumination (TIRF-SIM) to image dynamic biological processes with optical super-resolution in multiple colors.
संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी (सिम) के साथ ऑप्टिकल सुपर संकल्प इमेजिंग रासायनिक और जैव चिकित्सा विज्ञान में आणविक स्तर पर प्रक्रियाओं के दृश्य के लिए एक महत्वपूर्ण तकनीक है। हालांकि वाणिज्यिक सिम सिस्टम उपलब्ध हैं, सिस्टम है कि कस्टम वाणिज्यिक प्रणालियों मात कर सकते हैं प्रयोगशाला में तैयार कर रहे हैं, बाद में आम तौर पर इस्तेमाल करते हैं और सामान्य प्रयोजन के आवेदनों की आसानी के लिए, दोनों इमेजिंग निष्ठा और गति के मामले में बनाया गया है। यह लेख एक सिम प्रणाली कुल आंतरिक प्रतिबिंब (TIR) रोशनी का उपयोग करता है और एक संकल्प 100 एनएम तक पहुंचने में तीन रंगों में 10 हर्ट्ज के लिए ऊपर में इमेजिंग के लिए सक्षम है कि निर्माण के लिए एक में गहराई से गाइड प्रस्तुत करता है। सिम और TIRF के संयोजन के कारण, प्रणाली प्रतिद्वंद्वी प्रौद्योगिकियों की तुलना में बेहतर छवि के विपरीत है। इन विशेषताओं को प्राप्त करने के लिए, कई ऑप्टिकल तत्वों सभी उपलब्ध उत्तेजना wav के लिए रोशनी प्रकाश का ध्रुवीकरण राज्य और स्थानिक संरचना पर स्वचालित नियंत्रण सक्षम करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैंelengths। हार्डवेयर कार्यान्वयन और नियंत्रण पर पूर्ण विवरण अधिकतम अधिग्रहण फ्रेम दर प्राप्त करने पर जोर देने के साथ उत्तेजना प्रकाश पैटर्न पीढ़ी, तरंग दैर्ध्य, ध्रुवीकरण राज्य, और कैमरा नियंत्रण के बीच तुल्यकालन प्राप्त करने के लिए दिया जाता है। प्रणाली संरेखण और जांच के लिए एक कदम दर कदम प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया जाता है और प्राप्त संकल्प सुधार आदर्श परीक्षण नमूने पर मान्य है। वीडियो दर सुपर संकल्प इमेजिंग के लिए क्षमता जीवित कोशिकाओं के साथ प्रदर्शन किया है।
पिछले आधे दशक से अधिक, सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी परिपक्व और जीवविज्ञानी के हाथों में विशेषज्ञ प्रकाशिकी प्रयोगशालाओं से ले जाया गया है। वाणिज्यिक माइक्रोस्कोप समाधान ऑप्टिकल सुपर संकल्प को प्राप्त करने के लिए तीन मुख्य वेरिएंट के लिए मौजूद हैं: एक अणु स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी (SMLM), प्रेरित उत्सर्जन कमी माइक्रोस्कोपी (STED), और संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी (सिम) 1,2। SMLM photoactivated स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी (पाम) और स्टोकेस्टिक ऑप्टिकल पुनर्निर्माण माइक्रोस्कोपी (तूफान) के रूप में इस तरह के बड़े पैमाने पर ऑप्टिकल सेटअप की सादगी और उच्च स्थानिक संकल्प के वादे के कारण सबसे लोकप्रिय तकनीक से किया गया है, आसानी से 20 समुद्री मील दूर करने के लिए नीचे। एक अणु स्थानीयकरण के माध्यम से हालांकि सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी एक आंतरिक व्यापार बंद के साथ आता है: स्थानिक संकल्प प्राप्य व्यक्ति fluorophore localizations के लिए पर्याप्त संख्या में जमते, इसलिए अस्थायी समाधान सीमित पर निर्भर है। इमेजिंग गतिशील प्रक्रियाजीवित कोशिकाओं में es इसलिए समस्याग्रस्त हो जाता है के रूप में एक पर्याप्त रूप से ब्याज की संरचना के आंदोलन करते हुए भी उस समय एक छवि को फिर से संगठित करने के लिए पर्याप्त स्थानीयकरण घटनाओं के अधिग्रहण प्रस्ताव कलाकृतियों को रोकने के लिए नमूना चाहिए। आदेश में इन आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए, जीवित कोशिका SMLM प्रदर्शनों बहुत उत्तेजना शक्ति में वृद्धि से fluorophore photoswitching दरों में अपेक्षित वृद्धि प्राप्त की है, और इस phototoxicity और oxidative तनाव के बदले में ले जाता है, जिससे नमूना अस्तित्व बार और जैविक प्रासंगिकता 3 सीमित।
दोनों सिम और SMLM खत्म STED का एक स्पष्ट लाभ यह है कि यह मोटी नमूनों में सुपर संकल्प, लगभग 60 एनएम का उदाहरण पार्श्व संकल्प के साथ छवि के लिए organotypic मस्तिष्क स्लाइस में गहराई में 120 माइक्रोन से 4 हासिल की थी सकता है। SMLM या सिम का एक उद्देश्य के कार्यान्वयन के साथ इस तरह की गहराई में इमेजिंग अव्यावहारिक है, लेकिन या तो एकल अणु प्रकाश चादर या जाली प्रकाश शीट mic के साथ संभव हो जाता हैroscopy 5। वीडियो दर STED भी प्रदर्शन किया गया है और synaptic पुटिका गतिशीलता नक्शा करने के लिए प्रयोग किया जाता है, हालांकि अब तक इस दृश्य 6 के छोटे क्षेत्रों इमेजिंग तक ही सीमित कर दिया गया है।
कोशिका जीव विज्ञान और आणविक आत्म विधानसभा प्रतिक्रियाओं 7 में अनुप्रयोगों के लिए – 12 में कई बार के अंक से अधिक उच्च अस्थायी समाधान के साथ इमेजिंग की आवश्यकता है कि, संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी (सिम) के रूप में यह एक विशेष फ्लोरोसेंट की photophysical गुणों पर निर्भर नहीं है हो सकता है अच्छी तरह से अनुकूल जांच। सिम के इस निहित लाभ के बावजूद, अब तक इसके उपयोग मुख्य रूप से तय की कोशिकाओं या धीमी गति से चलती प्रक्रियाओं इमेजिंग तक ही सीमित कर दिया गया है। यह व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सिम सिस्टम की सीमाओं की वजह से है: इन उपकरणों के अधिग्रहण के फ्रेम दर की आवश्यकता sinusoidal रोशनी पैटर्न के रूप में अच्छी तरह से ध्रुवीकरण प्रकाशिकी बनाए रखने उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल gratings के रोटेशन की गति द्वारा सीमित था। वाणिज्यिक सिम की नई पीढ़ीउपकरणों तेज इमेजिंग में सक्षम हैं, लेकिन वे बेहद सब लेकिन केंद्रीय इमेजिंग सुविधाओं के लिए महंगे हैं।
इस प्रोटोकॉल पतली नमूनों में और निकट जीवित कोशिकाओं के बेसल सतह तेजी प्रक्रियाओं इमेजिंग के लिए एक लचीला सिम प्रणाली के निर्माण के लिए एक गाइड प्रस्तुत करता है। यह एक रोशनी पैटर्न जो नमूना 13 जो बेहद फोकस पृष्ठभूमि संकेत से बाहर कम कर देता में एनएम कोई लगभग 150 से अधिक गहरा प्रवेश उत्पन्न करने के लिए कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति (TIRF) कार्यरत हैं। TIRF के साथ सिम के संयोजन के विचार सिम में ही 14 के रूप में लगभग रूप में पुरानी है लेकिन 2006 से पहले 15 प्रयोगात्मक एहसास नहीं था। TIRF-सिम के साथ प्राप्त पहले इन विवो छवियों 11 हर्ट्ज की 16 फ्रेम दर को प्राप्त करने tubulin और kinesin कल्पना करने के लिए 2009 में सूचित किया गया गतिशीलता, और दो रंग TIRF-सिम सिस्टम 17,18 प्रस्तुत किया गया है। अभी हाल ही में निर्माण और एक ही रंग के दो-बीम सिम के उपयोग के लिए एक गाइडystem अप करने के लिए 18 हर्ट्ज 19,20 के फ्रेम दर की विशेषता प्रस्तुत किया गया था।
सेट-अप यहाँ प्रस्तुत तीन रंगों, जिनमें से दो TIRF-सिम में संचालित किया जा सकता है में 20 हर्ट्ज पर सिम सुपर संकल्प इमेजिंग के लिए सक्षम है। पूरे सिस्टम को एक औंधा माइक्रोस्कोप फ्रेम के आसपास का निर्माण और एक piezo actuated Z मंच के साथ एक मोटर चालित XY अनुवाद चरण का उपयोग करता है। TIRF-सिम के लिए आवश्यक sinusoidal उत्तेजना पैटर्न उत्पन्न करने के लिए, प्रस्तुत प्रणाली एक ferroelectric स्थानिक प्रकाश न्यूनाधिक (SLM) का उपयोग करता है। बाइनरी झंझरी पैटर्न SLM पर प्रदर्शित कर रहे हैं और जिसके परिणामस्वरूप ± 1 विवर्तन आदेश, छान relayed और उद्देश्य लेंस की TIR रिंग में ध्यान केंद्रित कर रहे हैं। आवश्यक चरण बदलाव और gratings का घुमाव प्रदर्शित किया SLM छवि को बदलने से लागू कर रहे हैं। इस प्रोटोकॉल का वर्णन बनाने के लिए और इस तरह के एक उत्तेजना पथ संरेखित करने के लिए कैसे, उत्सर्जन पथ के संरेखण का विवरण, और इष्टतम संरेखण सुनिश्चित करने के लिए परीक्षण के नमूने प्रस्तुत करता है। यह भी डे के मुद्दों और उच्च गति TIRF-सिम के लिए विशेष चुनौतियों का ध्रुवीकरण नियंत्रण और घटकों के तुल्यकालन के बारे में तो शास्त्री।
डिजाइन संबंधी और प्रतिबन्ध
इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत TIRF-सिम प्रणाली कोडांतरण से पहले, वहाँ कई डिजाइन की कमी है जो ऑप्टिकल घटकों के चुनाव को निर्धारित करने पर विचार कर रहे हैं। ऑप्टिकल घटकों के सभी संक्षिप्त 1 चित्रा को देखें।
स्थानिक प्रकाश न्यूनाधिक (SLM)
एक द्विआधारी ferroelectric SLM इस सेटअप में इस्तेमाल के रूप में यह उप millisecond पैटर्न स्विच करने में सक्षम है। स्केल Nematic SLMs इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन इन बहुत प्रदान करते हैं स्विचन समय कम। पर या पिक्सेल छूट हर एक द्विआधारी चरण में SLM, या तो एक π या 0 चरण घटना विमान wavefront करने के लिए ऑफसेट प्रदान करेगा इसलिए अगर एक आवधिक झंझरी पैटर्न SLM यह एक चरण विवर्तन झंझरी के रूप में काम करेंगे पर प्रदर्शित होता है।
ईएनटी "> कुल आंतरिक परावर्तन (TIR)TIR प्राप्त करने और एक क्षणभंगुर क्षेत्र का उत्पादन करने के लिए, गिलास नमूना इंटरफेस में उत्तेजना बीम की घटना कोण महत्वपूर्ण कोण से अधिक होना चाहिए । यह न्यूनतम घटना कोण की आवश्यकता है, और इसलिए भी अधिकतम रिक्ति, या अवधि, क्षणभंगुर रोशनी पैटर्न का सेट। अधिकतम घटना कोण (स्वीकृति कोण) उद्देश्य लेंस के संख्यात्मक एपर्चर (एनए) परिभाषा से गणना की जा सकती है जिसके द्वारा सीमित है । यह प्राप्त रिक्ति न्यूनतम पैटर्न को निर्धारित करता अब्बे सूत्र के अनुसार एनए और तरंग दैर्ध्य लिंक जिसमें न्यूनतम पैटर्न रिक्ति को <imgalt = "समीकरण" src = "/ files / ftp_upload / 53988 / 53988eq6.jpg" />। अभ्यास में, एक 1.49 एनए तेल विसर्जन TIRF उद्देश्य के चारों ओर 79 डिग्री की घटनाओं और 164 एनएम का नमूना 488 एनएम के एक उत्तेजना तरंगदैर्ध्य के प्रयोग पर एक न्यूनतम अवधि पैटर्न की एक अधिकतम कोण अर्जित करता है। इन दो कोणों उद्देश्य के पीछे एपर्चर जिस पर साधन TIR रोशनी (यानी। TIR रिंग) और जिसमें दो उत्तेजना foci सही तैनात किया जाना चाहिए प्राप्त होता है और ठीक प्रत्येक रोशनी पैटर्न उत्पन्न करने के लिए घुमाया में एक अंगूठी को परिभाषित।
TIRF-सिम छवियों के पुनर्निर्माण की आवश्यकता पैटर्न रोटेशन के अनुसार तीन चरण बदलाव की एक न्यूनतम के अधिग्रहण इसलिए SLM पैटर्न अवधि 3 से भाज्य होना चाहिए (चित्रा 1 देखें)। उदाहरण के लिए, 488 एनएम रोशनी के लिए 9 पिक्सल और 640 एनएम रोशनी के लिए 12 पिक्सल की अवधि। SLM पैटर्न डिजाइन के व्यापक चर्चा, sheared gratings का उपयोग कर रिक्ति पैटर्न के उप पिक्सेल अनुकूलन सहित के लिए, Kner एट अल। 16 और लू-वाल्थर एट अल। 20 दो उत्तेजना foci की स्थिति के पिछले काम, ± 1 आदेशों का हालांकि विवर्तन कोण को देखने के सभी तरंग दैर्ध्य के लिए TIR रिंग के अंदर होना चाहिए से SLM तरंग दैर्ध्य है निर्भर है। मानक सिम के लिए, बहुरंगा इमेजिंग सबसे लंबे समय तक तरंग दैर्ध्य के लिए झंझरी अवधि के अनुकूलन, और छोटे चैनलों के लिए प्रदर्शन में एक नुकसान बर्दाश्त द्वारा प्राप्त किया जा सकता है। TIRF-सिम के लिए हालांकि, एक तरंग दैर्ध्य के लिए अनुकूलन का मतलब है कि अन्य तरंग दैर्ध्य foci TIR रिंग के भीतर नहीं रह रहे हैं। उदाहरण के लिए, 9 पिक्सल के एक झंझरी अवधि का उपयोग कर 488 एनएम के लिए TIRF प्रदान करने के लिए पर्याप्त है, के रूप में foci वापस एपर्चर की और TIR रिंग के भीतर व्यास के 95% से कम हैं, लेकिन 640 एनएम के लिए इस अवधि के बाहर foci स्थिति होगी एपर्चर। इस कारण से अलग पिक्सेल पैटर्न spacings प्रत्येक उत्तेजना तरंगदैर्ध्य के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए।
TIRF-सिम उत्तेजना पथ के संरेखणपारंपरिक सिम में बेहद माइक्रोस्कोप शरीर में dichroic दर्पण की स्थिति में छोटे परिवर्तन (चित्रा 1 में DM4) के प्रति संवेदनशील है, बहुत अधिक तो नहीं है। एक घूर्णन फिल्टर क्यूब बुर्ज का उपयोग अनुशंसित नहीं है, बजाय एक एकल, बहु बैंड dichroic दर्पण है, जो उत्तेजना का इस्तेमाल किया तरंग दैर्ध्य के लिए एक निश्चित स्थिति में रखा है और विशेष रूप से बनाया गया है का उपयोग करें। यह जरूरी है कि केवल उच्चतम गुणवत्ता dichroic दर्पण इस्तेमाल कर रहे हैं। ये कम से कम 3 मिमी मोटी substrates की आवश्यकता होती है, और अक्सर "इमेजिंग फ्लैट" निर्माताओं द्वारा नामित कर रहे हैं। अन्य सभी substrates असहनीय विपथन और TIRF-सिम में छवि गिरावट के लिए नेतृत्व।
ध्रुवीकरण नियंत्रण
TIRF-सिम प्राप्त करने के लिए यह रोशनी पैटर्न के साथ synchronicity में उत्तेजना प्रकाश का ध्रुवीकरण राज्य बारी बारी से करने के लिए आवश्यक है कि इस तरह की यह ऑप्टिकल धुरी के संबंध में उद्देश्य पुतली विमान में azimuthally ध्रुवीकृत रहता है (यानी। एस-ध्रुवीकृत)। ध्रुवीकरण नियंत्रण प्रकाशिकी के संरेखण एक मोटर रोटेशन चरण 22 में एक Pockels सेल 21, या एक आधे लहर थाली, कार्यरत विशिष्ट ऑप्टिकल तत्व पर निर्भर करेगा उदाहरण के लिए। इस प्रोटोकॉल में एक कस्टम लिक्विड क्रिस्टल चर retarder (LCVR), प्रयोग किया जाता है तरंगदैर्ध्य रेंज पर पूरा-लहर (2π) retardance प्रदान करने के लिए डिज़ाइन किया गया 488 640 एनएम के रूप में यह अनुमति देता है तेजी से (~ मिसे) स्विचिंग करने के लिए। एक लिक्विड क्रिस्टल retarder का उपयोग अगर यह एक उच्च गुणवत्ता घटक का उपयोग करने के लिए आवश्यक है: मानक घटकों आम तौर पर काफी स्थिर कैमरा जोखिम समय के लिए होता है जो की लंबाई पर एक निरंतर retardance देने के लिए नहीं कर रहे हैं एक रोशनी पैटर्न और कम मॉडुलन विपरीत से बाहर धुंधला । लिक्विड क्रिस्टल retarders भी दृढ़ता से तापमान निर्भर कर रहे हैं और तापमान नियंत्रण में निर्मित की आवश्यकता होती है।
तुल्यकालन
लेज़रों SLM के साथ सिंक्रनाइज़ किया जाना चाहिए। बाइनरी ferroelectric SLMs आंतरिक रूप से रों से संतुलित कर रहे हैंराज्य पर और राज्य से एक के बीच witching। पिक्सल केवल या तो अपने पर या राज्य से दूर है, लेकिन नहीं दौरान interframe स्विचन समय में आधे के रूप में लहर प्लेटों काम करते हैं। इसलिए लेज़रों पर ही बंद / पर राज्यों के दौरान एलईडी के माध्यम से पैटर्न विपरीत में कमी को रोकने के लिए SLM से संकेत सक्षम पिक्सल के मध्यवर्ती राज्य होने के कारण बंद किया जाना चाहिए। यदि लेज़रों डिजिटल संग्राहक नहीं जा सकता है एक acousto ऑप्टिक न्यूनाधिक (AOM) वैकल्पिक रूप से एक तेजी से शटर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।
लेंस की पसंद
इन बाधाओं के आधार पर, उत्पादन करने के लिए नमूना विमान पर SLM विमान के लिए जरूरी demagnification वांछित रोशनी पैटर्न निर्धारित किया जा सकता है। यह दो लेंस L3 और L4 की छवि रिले दूरबीन और उत्तेजना कंडेनसर लेंस L5 में की फोकल लंबाई की गणना के लिए अनुमति देता है। इस प्रणाली में एक 100X / 1.49NA तेल विसर्जन उद्देश्य लेंस 488 एनएम और 640 एनएम उत्तेजना के साथ प्रयोग किया जाता है, इसलिए 300 और 140 मिमी की फोकल लंबाई का उपयोग करता हैL4 और L3, और L5 के लिए 300 मिमी, 357X की कुल demagnification, नमूना विमान में 38 एनएम के एक SLM पिक्सेल आकार के बराबर देने के लिए। लेंस के इस संयोजन का उपयोग करना, SLM 488 एनएम रोशनी और 640 एनएम नमूना में 172 और 229 एनएम का पैटर्न spacings देने के लिए 12 पिक्सल के लिए 9 की अवधि झंझरी, 70 डिग्री और 67 डिग्री के कोण क्रमशः की घटनाओं के लिए इसी। एक गिलास पानी इंटरफेस के लिए, महत्वपूर्ण कोण 61 डिग्री है, और तरंग दैर्ध्य से स्वतंत्र है, इसलिए इन दोनों के पैटर्न spacings दोनों तरंग दैर्ध्य के लिए TIRF उत्तेजना अनुमति देते हैं। , या अगर 37 डिग्री सेल्सियस पर काम कर रही एक उद्देश्य के लिए एक सुधार कॉलर से लैस लेंस coverslip मोटाई में बदलाव द्वारा शुरू की गोलाकार aberrations के सुधार के लिए उपयोगी है।
छवि पुनर्निर्माण
एक बार जब कच्चे सिम डेटा अधिग्रहण किया गया है यह एक दो कदम प्रक्रिया में सुपर हल छवियों को उत्पन्न करने के लिए कम्प्यूटेशनल प्रयास का एक मामला है। सबसे पहले, रोशनी पैटर्न के लिए निर्धारित किया हैहर छवि और दूसरी बात, सिम स्पेक्ट्रम के घटकों को अलग कर दिया और उचित रूप से recombined प्रभावी OTF समर्थन (चित्रा 6 देखते हैं, insets) डबल के रूप में किया जाना चाहिए।
अनुमान रोशनी पैटर्न का सटीक ज्ञान सर्वोपरि है, के रूप में सुपर हल आवृत्ति घटकों अमिश्रित के रूप में सही रूप में ओवरलैपिंग घटकों के अवशिष्ट भागों की वजह से कलाकृतियों को रोकने के लिए संभव हो सकता है। हम निर्धारित रोशनी पैटर्न प्रक्रिया Gustafsson एट अल। 23 संक्षेप में, रोशनी मानकों का एक सेट है कि एक सामान्यीकृत दो आयामी sinusoid का वर्णन द्वारा शुरू निम्नलिखित कच्चे छवि डेटा से एक अनुभवजन्य मानकों में से प्रत्येक के लिए मिल सकता है उत्तेजना पैटर्न :
इसके द्वारा तथा हाशिये पर विपरीत और पैटर्न के साथ क्रमश: प्रत्येक व्यक्ति की छवि मीटर के चरण शुरू करने का वर्णन है। लहर वेक्टर के घटकों, तथा , केवल अलग झुकाव के साथ बदलना पैटर्न और कर सकते हैं के अन्यथा स्थिर माना। कटा लहर वेक्टर कच्चे छवि स्पेक्ट्रा के एक पार सहसंबंध किया जाता है, जो के रूप में ओवरलैप अनुकूलन करने के लिए पार से सहसंबद्ध छवियों में से एक के लिए सब-पिक्सेल पारियों लगाने से परिष्कृत किया जाता है के घटकों का निर्धारण करने के लिए। यह वास्तविक अंतरिक्ष चरण ढ़ाल के गुणन के माध्यम से किया जाता है कि fre में एक सब-पिक्सेल पारी प्रेरितquency-स्पेस। ध्यान दें कि यह वास्तविक पैटर्न के आकलन के लिए पहले लहर-वैक्टर का एक अच्छा अनुमान है करने के लिए उपयोगी है और यह एक फ्लोरोसेंट मनका परत इमेजिंग द्वारा पाया जा सकता है।
स्थानांतरित कर दिया पैटर्न के बीच चरण कदम के रूप में , अर्थात्। , आवृत्ति घटकों की जुदाई "चरण अक्ष" के साथ बदलना एक फूरियर द्वारा प्रदर्शन किया जा सकता है। वैश्विक चरण और हाशिये पर विपरीत उसके बाद विभिन्न घटकों के जटिल रेखीय प्रतिगमन का उपयोग निर्धारित किया जा सकता है। अलग-अलग अलग घटकों तो एक सामान्यीकृत वीनर फिल्टर का उपयोग संयुक्त रहे हैं। दोनों पैरामीटर निष्कर्षण और सामान्यीकृत वीनर फिल्टर के कार्यान्वयन के एक विस्तृत वर्णन के लिए हम Gustafsson के लिए पाठक का उल्लेखएट अल। 23 जहां एक ही एल्गोरिथ्म प्रयोग किया जाता है।
इस तरह इस प्रोटोकॉल में विस्तृत सेटअप के रूप में कस्टम निर्मित TIRF-सिम सिस्टम व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सूक्ष्मदर्शी की तुलना में उच्च गति पर बहुरंगा सुपर संकल्प इमेजिंग में सक्षम हैं। एक सुपर संकल्प तकनीक के रूप में सिम के निहित लाभ यह है कि अस्थायी समाधान इस तरह के एक अणु स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी (SMLM) या ऐसे प्रेरित उत्सर्जन कमी माइक्रोस्कोपी के रूप में बिंदु स्कैनिंग तरीकों (के रूप में अन्य तरीकों की तुलना में, की fluorophore photophysics द्वारा सीमित नहीं है STED)। इन अन्य तकनीकों के विपरीत, सिम photoswitchable या depletable fluorophores की आवश्यकता नहीं है इसलिए बहुरंगा इमेजिंग सीधा है। सिम और मल्टीफोकल सिम सेक्शनिंग जैसे ऑप्टिकल के रूप में गैर-सिम TIRF प्रणाली, आमतौर पर के रूप में 2 सुधार के कारक यहां बताया करने के लिए विरोध व्यवहार में 1.7 गुना या उससे कम का संकल्प सुधार प्राप्त कर सकते हैं, और वाणिज्यिक प्रणालियों भी अक्सर धीमी है और इस प्रणाली की तुलना में कम कर रहे हैं लचीला इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत किया।
"> इस तकनीक को लागू करने में दो मुख्य कठिनाइयों सबसे पहले उद्देश्य के पीछे एपर्चर है, जो एक कठिन और समय लेने वाली ऑप्टिकल संरेखण प्रक्रिया की आवश्यकता के TIR क्षेत्र के भीतर छह सिम बीम की सटीक स्थिति के लिए आवश्यकता है। दूसरे, उच्च पैटर्न विपरीत निर्माण करने के लिए नमूना पर, ध्रुवीकरण रोटेशन जरूरी है। कम NA 2 डी-सिम सिस्टम के लिए, ध्रुवीकरण रोटेशन रेखीय ध्रुवीकरण उन्मुखीकरण के सावधान रहना पसंद से बचा जा सकता है, लेकिन इस TIRF-सिम 25 के लिए असंभव हो जाता है। उच्च गति बहुरंगा इमेजिंग के लिए, विद्युत ऑप्टिकल ध्रुवीकरण नियंत्रण आवश्यक है और इस जटिलता और सिस्टम की कीमत बढ़ जाती है।तकनीक की सीमाएं
TIRF-सिम, पारंपरिक TIRF की तरह है, स्वाभाविक रूप से जैविक संरचनाओं और बेसल कोशिका झिल्ली कि क्षणभंगुर क्षेत्र के 150-200 एनएम प्रवेश गहराई से प्रकाशित किया जा सकता है पर स्थित प्रक्रियाओं का अवलोकन करने के लिए सीमित है। जबकिसिम अक्सर या तो STED या SMLM, पार्श्व संकल्प दोहरीकरण अभी भी कम से कम 4 गुना 5 से फोटॉनों की अपेक्षित संख्या में वृद्धि करता है पारंपरिक TIRF माइक्रोस्कोपी की तुलना में कोशिकाओं को कम photodamaging होने के रूप में उद्धृत किया गया है। कम जोखिम के समय के साथ उच्च फ्रेम दर पर इमेजिंग के लिए, इस फोटॉन वृद्धि वृद्धि हुई रोशनी तीव्रता का उपयोग जरूरी है। किसी भी fluorophore निश्चित या धीमी गति से चलती नमूने, उच्च चमक फ्लोरोसेंट प्रोटीन या बढ़ाया photostability के साथ अगली पीढ़ी सिंथेटिक रंगों का सिम इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जबकि लाइव सेल इमेजिंग के लिए सिफारिश कर रहे हैं।
हालांकि इस कार्यान्वयन 20 हर्ट्ज से अधिक सिम फ्रेम दर पर एक ही रंग इमेजिंग में सक्षम है, प्रस्तुत प्रणाली में बहुरंगा इमेजिंग मोटर चालित उत्सर्जन फिल्टर पहिया की स्विचिंग समय से सीमित है। sCMOS कैमरा चिप के बड़े आकार के कारण, एक multiband उत्सर्जन फिल्टर और छवि बंटवारे प्रकाशिकी के उपयोग संभव हो सकता है और एक साथ मैं अनुमति होगीकोई गति की सजा पर कई तरंग दैर्ध्य के साथ maging। एक और संभावना विभिन्न उत्तेजना लेज़रों वैकल्पिक और उत्तेजना प्रकाश अस्वीकार करने के लिए एक multiband पायदान फिल्टर का उपयोग करने के लिए किया जाएगा। इस कार्यान्वयन में एक द्विआधारी ferroelectric SLM का उपयोग भी इष्टतम नहीं है। इस तरह के एक SLM के विवर्तन दक्षता बहुत कम है, इसलिए घटना के प्रकाश के सबसे शून्य के आदेश प्रतिबिंब है, जो स्थानिक मुखौटा द्वारा फ़िल्टर है में है। बहुत उच्च फ्रेम दर की आवश्यकता होती है अनुप्रयोगों के लिए, इमेजिंग गति इसलिए लेजर डायोड का उत्पादन शक्ति द्वारा सीमित है। SLM भी तरंग दैर्ध्य 550 एनएम तरंगदैर्ध्य डिजाइन जहां पिक्सल के रूप में आदर्श आधे लहर प्लेटों काम नहीं कर से दूर के लिए ध्रुवीकरण में कुछ अण्डाकार का परिचय। हालांकि यह एक अतिरिक्त LCVR का उपयोग करके के लिए मुआवजा दिया जा सकता है, आदर्श समाधान एक पैटर्न जनरेटर के रूप में एक डिजिटल माइक्रो दर्पण डिवाइस (डीएमडी) का उपयोग किया जा सकता है।
संभावित संशोधनों
सेटअप preseयहाँ nted लचीला और अधिक आसानी से वाणिज्यिक उपकरणों ऐसी 3 डी-सिम, तेजी से 2 डी-सिम, मल्टीफोकल सिम (MSIM) और गैर रेखीय सिम (NL-सिम) के रूप में तो अन्य इमेजिंग तौर तरीकों 21,34,35 लागू किया जा सकता से संशोधित है।
2 डी-सिम अच्छी तरह से अपेक्षाकृत सपाट इमेजिंग, तेजी से इस तरह परिधीय जालिका के रूप में संरचनाओं बढ़ने के लिए अनुकूल हो सकता है। परिधीय ईआर अपने फ्लैट संरचना के कारण से एक TIRF क्षणभंगुर क्षेत्र लेकिन का उपयोग कर प्रबुद्ध किया जा सकता कोशिका के भीतर गहरे निहित है नगण्य बाहर का ध्यान केंद्रित पृष्ठभूमि के साथ मानक 2 डी-सिम का उपयोग imaged किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, बेहतर ऑप्टिकल सेक्शनिंग पुनर्निर्माण एल्गोरिदम के उपयोग को दबाने के लिए बाहर का ध्यान केंद्रित प्रकाश 2 डी-सिम के उपयोग ऑप्टिकली मोटी नमूने, यद्यपि जहां अक्षीय संकल्प दोहरीकरण 21 की आवश्यकता नहीं है के लिए करता हूं।
MSIM में, नमूना उत्तेजना foci 36 की एक विरल जाली द्वारा प्रकाशित किया जाता है। इस साधन बस स्थानिक नकाब हटाने के द्वारा लागू किया जा सकता है (एस.एम.) है और यह एक polarizer द्वारा की जगह ले। SLM अब एक आयाम न्यूनाधिक रूप में चल रही है। SLM पर प्रदर्शित बाइनरी सिम gratings स्पॉट छवि विमान में एक विवर्तन सीमित फोकस के आकार के बराबर होने के लिए चुना के आकार के साथ, स्थानों की एक 2 डी जाली द्वारा बदला जा सकता है। चित्रा 7A में, 4 x 4 पिक्सेल चौकों की एक जाली SLM (इनसेट) जो जब नमूना पर demagnified 150 x 150 एनएम के विवर्तन सीमित foci उत्पन्न करता है पर प्रदर्शित, 13.62 मीटर की शारीरिक SLM पिक्सेल आकार दिया जाता है। उत्तेजना foci तो SLM पर जाली पैटर्न स्थानांतरण द्वारा अनुवाद किया जा सकता है और इस क्रम में देखने के पूरे क्षेत्र को रोशन करने में कई बार दोहराया है। छवियों प्रत्येक अनुवाद पैटर्न पद के लिए अधिग्रहण कर रहे हैं और ढेर है का एक पहलू अप करने के लिए सुधार के प्रस्ताव के साथ एक खंगाला छवि उपज के बाद संसाधित और कम से बाहर का ध्यान केंद्रित प्रकाश बराबर widefield छवि की तुलना में30। इस साधन, मोटी, घने नमूने जिसके लिए मानक सिम ऐसे दाग लाल रक्त कोशिकाओं (चित्रा 7) के रूप में अनुपयुक्त है, उदाहरण के कम विपरीत संरचनाओं के लिए इमेजिंग के लिए उपयोगी हो सकता है, हालांकि अधिग्रहण के समय कच्चे तख्ते की बड़ी संख्या के कारण बढ़ रहा है देखने के क्षेत्र प्रति आवश्यक (इस मामले में एन = 168)।
अंत में, सेटअप के रूप में ली एट अल द्वारा हाल ही में प्रस्तुत किया है, तो उच्च-NA रेखीय TIRF-सिम या नमूनों सक्रियण गैर रेखीय सिम (पीए नाथन सिम) सक्षम करने के लिए संशोधित किया जा सकता है।, एक ultrahigh 1.7 NA उद्देश्य या इसके अतिरिक्त के उपयोग के द्वारा एक 405 एनएम photoactivation लेजर और SLM झंझरी पैटर्न 35 से सावधान अनुकूलन की।
भविष्य के अनुप्रयोगों
सिम अभी भी एक तेजी से विकसित तकनीक है और जीवन विज्ञान में कई आवेदन भविष्य में सक्षम हो जाएगा। गति, संकल्प, और इसके विपरीत तकनीक के संवर्द्धन और मानक fluorophores मीटर का उपयोग करने की क्षमताEAN bioimaging के लिए, सिम ऐसे confocal और विस्तृत क्षेत्र प्लेटफॉर्म के रूप में पारंपरिक कई माइक्रोस्कोप प्रणाली, को बदलने के लिए सेट कर दिया जाता है। वाणिज्यिक सिम सिस्टम महत्वपूर्ण बात, वे संशोधित और क्षेत्र में नवीनतम अनुसंधान के घटनाक्रम को लागू करने के लिए विकसित किया जाना है अनम्य हैं पहले से ही बकाया तकनीकी विशिष्टताओं के साथ आज उपलब्ध हैं, तथापि, वे कई अनुसंधान प्रयोगशालाओं की वित्तीय पहुँच से बाहर हैं, और। उन्होंने यह भी कमी है आवश्यक क्षमता, अक्सर बढ़त जीवन विज्ञान अनुसंधान काटने में एक महत्वपूर्ण टोंटी 'हाथ में प्रयोग के लिए अनुकूलित किया जा'। यहाँ वर्णित प्रणाली विशेष रूप से अच्छी तरह से पुनर्गठन bilayer प्रणालियों के इन विट्रो अध्ययन के लिए, कोशिका की सतह के पास गतिशील प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए, सामग्री और भौतिक विज्ञान, उदा में सतह के रसायन शास्त्र का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त हो जाएगा। 2 डी सामग्री, और कई अन्य अनुप्रयोगों की।
The authors have nothing to disclose.
इस काम Leverhulme ट्रस्ट, इंजीनियरिंग और शारीरिक विज्ञान अनुसंधान परिषद से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था [ईपी / H018301 / 1, ईपी / G037221 / 1]; अल्जाइमर रिसर्च यूके [ARUK-EG2012A-1]; वेलकम ट्रस्ट [089703 / Z / 09 / Z] और चिकित्सा अनुसंधान परिषद [एमआर / K015850 / 1, एमआर / K02292X / 1]। हम क्रमशः डब्ल्यू चेन साइटोसोलिक-GFP कोशिकाओं LifeAct-GFP के अभिकर्मक और के लिए ई Avezov और एम लू का शुक्र है, और HEK293 संस्कृति की तैयारी के लिए। हम यह भी उपयोगी विचार विमर्श और सुझाव के लिए माइक्रोस्कोप के डिजाइन के साथ सहायता के लिए लालकृष्ण O'Holleran धन्यवाद, और एल शाओ और आर Heintzmann।
488 nm laser | Toptica | iBeam SMART | with digital modulation |
561 nm laser | Coherent | OBIS LS | with digital modulation |
640 nm laser | Cobolt | MLD | with digital modulation |
Long-pass dichroic mirrors | Thorlabs | for combining excitation beams | |
Quad band dichroic mirror | Chroma | ZT405/488/561/640rpc | 3 mm thick, TIRF imaging flat, mounted in Olympus BX filter cube |
Quad band dichroic mirror | Chroma | ZT405/488/561/640rpc | From same batch as above, 25 x 25 mm |
1" square kinematic mount | Edmund Optics | 58-860 | |
Glan-Taylor calcite polarizers | Thorlabs | GT5-A | For alignment of LCVR |
Glan-Taylor mount | Thorlabs | SM05PM5 | |
Achromatic half wave plate | Thorlabs | AHWP05M-600 | 400 – 800 nm |
Rotation cage mount | Thorlabs | CRM1/M | For HWP |
Liquid Crystal Variable Retarder | Meadowlark Optics | SWIFT | Custom built to provide full wave retardance over the range 488 to 640 nm. |
LCVR controller | Meadowlark Optics | D3060HV | Two channel high voltage controller for liquid crystal retarders |
Achromatic quarter wave plate | Meadowlark Optics | AQM-100-0545 | |
Rotation cage mount | Thorlabs | CRM1P/M | For QWP |
10 mm achromatic doublet | Thorlabs | AC080-010-A-ML | For beam expander |
200 mm achromatic doublet | Thorlabs | AC254-200-A-ML | For beam expander |
Cage XY Translators | Thorlabs | CXY1 | |
Ferroelectric spatial light modulator | Forth Dimension Displays | M0787-00249 | SXGA-3DM (IFF) Microdisplay Type M249, 1280 x 1024 pixels, with driver board |
SLM mounting frame | Forth Dimension Displays | M0787-10014 | Fixed to custom built aluminium mount |
Ø50.8 mm Gimbal Mirror Mount | Thorlabs | GM200/M | For SLM mounting |
Two-Axis Linear Translation Stage with Rotating Platform | Thorlabs | XYR1/M | For SLM mounting |
Rail carrier | Newport | M-PRC-3 | For SLM mounting |
Precision Optical Rail | Newport | PRL-6 | For SLM mounting |
300 mm achromatic doublet lens | Qioptiq | G322 273 322 | f = 300 mm, 31.5 mm diameter |
140 mm achromatic doublet lens | Qioptiq | G322 239 322 | f = 140 mm, 31.5 mm diameter |
Precision XY Translation Mounts | Thorlabs | LM2XY | |
Lens Mounting Adapters | Thorlabs | SM2AD32 | For mounting 31.5 mm lenses in 2" mounts |
Translation stages | Comar | 12XT65 | Dovetail, side drive |
XY Translator with Differential Drives | Thorlabs | ST1XY-D/M | for spatial filter |
Rotation cage mount | Thorlabs | CRM1/M | for spatial filter |
300 mm achromatic doublet | Thorlabs | AC508-300-A-ML | Excitation tube lens |
Automated XY stage with Z-piezo top plate | ASI | PZ-2150-XYFT-PZ-IX71 | with MS-2000 controller |
Inverted microscope frame | Olympus | IX-71 | |
Objective lens | Olympus | UAPON100XOTIRF | 100X/1.49NA |
High speed filter wheel | Prior Scientific | HF110A | with Prior ProScan III controller |
Bandpass emission filters | Semrock | FF01-525/30, FF01-676/29 | |
sCMOS camera | Hamamatsu | ORCA Flash v4.0 | |
Stage top incubator | OKO Lab | H301-K-FRAME | For live cell imaging, with Bold Line temperature and CO2 controllers |
Stainless steel optical posts | Thorlabs | TR series | for mounting optical components |
Post holders | Thorlabs | PH series | for mounting optical components |
Kinematic mirror mounts | Thorlabs | KM100 | for mounting 1" mirrors |
Shearing interferometer | Thorlabs | SI100 | |
100 nm fluorescent microspheres | Life Technologies | T-7279 | Tetraspeck |
Rhodamine 6G | Sigma Aldrich | 83697-250MG | |
8 well glass bottom dishes | ibidi | 80827 | with #1.5 coverglass |
Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass | Thermo Fisher Scientific | 155409 | with #1.5 coverglass |
0.01mm microscope reticle slide | EMS | 68039-22 | |
CellLight Tubulin-GFP, BacMam 2.0 | Thermo Fisher Scientific | C10613 |