공동 배양 시험 법은 아교 모세포종 침략의 대 식세포와 미세 아교 세포 자극을 공부하기
Summary
Understanding the malignant behavior of cancer requires creating accurate models of how tumor cells interact with components of the tumor microenvironment, such as macrophages. Here we describe two methods to study glioblastoma cell interaction with tumor associated macrophages and microglia where the effect on glioblastoma invasion is assessed.
Abstract
아교 모세포종의 홍반 (등급 IV 신경 교종)은 1 년 후 진단의 평균 생존에 매우 적극적인 인간의 암이다. 아교 모세포종을 야기 분자 사건의 증가 이해에도 불구하고,이 암은 여전히 기존의 치료에 매우 내화 남아있다. 고급 뇌 종양의 수술 적 절제로 인해 아교 모세포종 세포의 높은 침윤성 특성으로 거의 완료되었습니다. 아교 모세포종 세포 침공을 약화 치료 방법 따라서 매력적인 선택이 될 것입니다. 우리의 실험실과 다른 사람은 종양 관련된 대 식세포와 미세 아교 세포 (상주 뇌 식세포) 강하게 아교 모세포종의 침략을 자극을 보여 주었다. 이 문서에서 설명하는 프로토콜은 체외 배양 분석을 사용하여 아교 모세포종 – 대 식세포 / 미세 아교 세포의 상호 작용을 모델링하는 데 사용됩니다. 이러한 접근 방식은 크게이 악성 behav 가능 식세포와의 통신을 방해 약물의 개발 및 / 또는 검색을 용이하게 할 수있다IOR. 10 배 – 우리는 미세 아교 세포 / 대 식세포는 5 신경 교종 세포 침공을 자극하는 두 가지 강력한 공 배양 침공 분석을 설립했다. 형광 마커 또는 구조적 형광 단백질을 발현 표지 아교 모세포종 세포 기질 코팅 폴리 실에 삽입하지 않고 식세포 / 미세 아교 도금 또는 입체 매트릭스에 포함된다. 세포 침윤은 필터의 하부에만 침입 세포 이미지를 형광 현미경을 사용하여 카운트에 의해 평가된다. 이러한 분석을 사용하여 여러 가지 약리 억제제 (JNJ-28312141는 PLX3397, 피티 니브 및 Semapimod) 대 식세포를 차단, 확인 된이 / 미세 아교 세포는 아교 모세포종의 침략을 자극.
Introduction
아교 모세포종의 홍반 진단 1, 2의 시간에서 약 12 개월 평균 생존과 적극적인 인간의 뇌 암이다. 교 모세포종은 표준 화학 요법과 수술 적 절제에 난치성 인으로 가장 치명적인 임상 도전 암 중 하나입니다. 아교 모세포종의 확산 특성은 수술로 완전히 절제에 고급 종양이 사실상 불가능하게 정상 뇌 전체에 확산 종양 세포 수 있습니다. 이 매우 침습적 인 측면은 교 모세포종 및 기타 고급 성상 세포종의 특징 특징이다. 따라서, 많은 연구의 초점은 아교 모세포종 세포 침윤의 분자 메커니즘왔다. 아교 모세포종 종양 미세 환경은 악성 종양 3-6 확립에 중요한 역할을한다. 종양 관련된 대 식세포는 / 미세 아교 세포는 아교 모세포종 침공 7,8 홍보에 대한 책임 것으로 나타났다. 이러한 연구의 대부분은 사용하지만 식세포 / 미세 아교 세포의 효과를 측정물리적으로 아교 모세포종 세포에서 구분 분석. 우리의 실험은 우리가 아교 모세포종 침공이 공 배양에서 대 식세포 / 미세 아교 세포에 의존하는 방법을 연구하고 침략하는 동안 이미지에 그들 사이의 물리적 상호 작용을 우리를 활성화 할 수 있도록 개선 된 분석을 생성하기 위해 밖으로 설정하고있다.
클래식 분석은 세포 침공은 "표준"보이든 챔버 화성과 chemoinvasion 형식을 포함 측정합니다. 공부하는 여기에 세포를 지정된 크기 (직경 일반적으로 사이 0.4 및 8 μM)의 구멍이 하단에 폴리 카보네이트 필터가 포함 된 플라스틱 챔버에서 도금. 세포 침윤의 방법은 일반적으로 세포 외 매트릭스 단백질로 이루어진 물리적 배리어를 포함한다. chemoinvasion 분석에서 사용 된 바람직한 행렬은 마트 리겔 (이하, "매트릭스"라 함), Engelbreth-Holm이 – 스웜 (EHS)에 의해 분비 된 세포 외 매트릭스 단백질의 혼합물을 마우스 육종 세포이며 크게 COL 이루어져lagen 유형 IV 및 라미닌. 챔버 후 또는 침윤을 촉진하는 것으로 의심되는 성장 인자없이 세포 배양액을 포함하는 조직 배양 웰에 배치된다. 더 높은 주파수에서 세포 외 기질 코팅 된 필터를 통해 침투하고, 필터의 하측에 부착하는 높은 침윤성 용량 셀. 우리는 아교 모세포종 세포 침윤에 미세 아교 세포 및 종양 연관된 대 식세포의 역할을 평가하기 위해이 시험을 수정했다.
10 배 9,10 – 우리는 미세 아교 세포는 5 개의 아교 모세포종 세포 라인의 침공을 자극 할 수있는이 문서에서 설명 공 배양 분석을 사용하여 확인 할 수 있었다. 이 아교 모세포종의 동물 모델에서 관찰되는 것을 반영한다. 더욱이, 우리는 아교 모세포종 세포와 대 식세포 간의 상호 작용 / 미세 아교 세포가보다 직접적으로 검토 할 수있는 입체 침윤 분석을 개발 하였다. macropha에 의해 자극 아교 모세포종 세포 침윤의 정도3 차원 분석에서 GES / 미세 아교 매트릭스 코팅 챔버 방식을 사용하여 본 것과 대등하다. 비슷한 분석은 이전에 침공 11 ~ 13시 대 식세포와 유방암의 상호 작용을 연구하기 위해 개발되었다. 이 문서에 설명 된 두 가지 방법은 아교 모세포종 세포의 식세포 / 미세 아교 세포 자극 침공의 분자 메커니즘 (들)을 해부 할 수있는 능력에 도움이됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
높은 등급의 성상 세포종과 교 모세포종의 매우 침습적 인 특성은 이러한 뇌 암은 매우 치명적인합니다. 그것은 아교 모세포종 침공의 분자 및 세포 메커니즘을 이해하는 것이 가장 중요하다. 많은 아교 모세포종 침공 이미 17의 과정에 대해 알게되었습니다. 10 배 -이 문서에 설명 된 분석 형식을 사용하여, 우리 연구실은 종양 관련된 대 식세포는 5 신경 교종 세포 침공을 자극 할 수있는 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Dr. Konstantin Dobrenis for providing murine microglia for these studies.
Materials
| Corning BioCoat Matrigel Invasion Chamber: With BD Matrigel Matrix | Corning/Fisher Scientific | Cat: 354481 | |
| Macrophage Serum Free Media (MSFM) (500 ml) | Life Technologies | 12065-074 | |
| CellTracker Red CMTPX Dye | Life Technologies/Molecular Probes | C34552 | |
| CellTracker Green CMFDA Dye | Life Technologies/Molecular Probes | C2925 | |
| GL261 cell line | National Cancer Institute (NCI) | ||
| U87 cell line | American Tissue Type Culture Collection | HTB-14 | |
| THP-1 cell line | American Tissue Type Culture Collection | ATCC TIB-202 | |
| RPMI 1640 Medium (500 ml) | Life Technologies/Gibco | 11875-093 | |
| Formaldehyde solution | Sigma Aldrich | F1635 | |
| Corning Transwell polycarbonate membrane cell culture inserts (8 µM pore) 48 per pack. | Corning | CLS3422 | |
| Cultrex 3-D Culture Matrix Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, PathClear | Trevigen | 3445-005-01 | |
| Fetal Calf Serum (FBS) | Life Technologies | Cat: 10500064 | |
| Bovine Serum Albumin, Fraction V, Heat Shock Treated | Fisherscientific | BP1600-100 | |
| 0.5M EDTA | ThermoFisher Scientific | 15575-020 | |
| phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma Aldrich | P8139-1MG |
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