Protocol
Déclaration d' éthique: Les protocoles pour la manipulation des animaux ont été approuvés par le Vanderbilt Institutional Animal Care et utilisation Commission (IACUC, protocoles nombre M / 10/117 (porcine) et M / 10/219 (souris) et menées conformément aux normes AAALAC-International. l'utilisation de tissus cardiaques humaines en banque a été approuvé par l'Université Vanderbilt Medical Center IRB (numéro de protocole 100887).
1. Exemple de collecte et de stockage
- Faire frais glutaraldéhyde 4% dans un tampon phosphate 0,1 M (PB) solution.
ATTENTION: glutaraldéhyde est toxique, porter des gants et des travaux dans une hotte.- Faire une solution 0,2 M d'actions de PB, pH 7,4 en utilisant 21,8 g de Na 2 HPO 4 et 6,4 g de NaH 2 PO 4. Quantum satis (Qs) à dH 2 O. 1000
- Ajouter 400 ul de 50% de glutaraldéhyde à 2,5 ml de solution mère PB et 2,1 ml dH 2 O.
- Immerger un morceau (pas plus de 2 cm 2) du tissu dans la solution de glutaraldéhyde à 4%. Nota: Les morceaux plus petits peuvent également être utilisés mais ils doivent être de taille suffisante (pas inférieure à 5 mm 2) pour être facilement visualisés à l'oeil nu, afin de faciliter les étapes ultérieures du protocole.
- Incuber à température ambiante pendant 1 heure, puis stocker indéfiniment à 4 ° C.
2. décellularisation du tissu cardiaque
- Faire une nouvelle solution aqueuse à 10% de NaOH en utilisant 10 g de NaOH pellets / dH 2 O. 100
ATTENTION: des solutions de NaOH sont corrosifs et peuvent causer des brûlures aux alcalis, des gants portent. - Rincer le tissu dans dH 2 O.
- Incuber dans une solution de NaOH à 10% à la température ambiante pendant 6 - 10 jours (jusqu'à ce que les changements de tissus provenant de brun rougeâtre à blanc cassé ou blanc).
- Rincer à l' dH 2 O jusqu'à ce que le tissu devient transparent.
- Immerger le tissu dans de l'acide tannique à 1% pendant 4 heures à la température ambiante. Utiliser 1 ml 5% solution mère par 4 ml dH 2 O.
ATTENTION: L'acide tanniqueest un puissant irritant, porter des gants. - Rincer à l' dH 2 O nuit.
3. Osmication et Déshydratation du tissu cardiaque (dans des hottes pour la sécurité)
- Faire une solution 0,2 M d'actions de tampon de cacodylate de sodium en utilisant cacodylate de sodium 21,4 g, 10,0 g de chlorure de calcium et 450 ml dH 2 O. Mélanger puis ajouter de l' acide chlorhydrique au besoin pour ajuster le pH à 7,4. Qs à 500 ml avec dH 2 O.
ATTENTION: cacodylate de sodium et de l'acide chlorhydrique sont toxiques, porter des gants et des travaux dans une hotte. - Faites solution mère aqueuse à 2% de tétroxyde d'osmium dans la hotte pour la sécurité en dissolvant 1 g de tétroxyde d' osmium cristal dans 50 ml dH 2 O.
ATTENTION: tétroxyde Osmium est un danger d'inhalation sévère; fixation vapeur de membranes muqueuses ou des globes oculaires est possible, poignée donc seulement dans la hotte avec des gants. Un garde-boue est recommandé. - Rincer le tissu dans un tampon cacodylate de sodium 0,1 M (mélanger la solution de stock 1: 1 avec dH
- Répétez l'étape précédente à deux reprises, pour un total de trois rinçages tampons.
- Immergez tissu dans 1% de tétroxyde d'osmium dans 0,1 M tampon cacodylate de sodium (mix cacodylate stock sodium et le stock tétroxyde d'osmium 1: 1) sur la coiffe pendant 1 h.
- Rinçage du tissu dans un tampon de cacodylate de sodium 0,1 M 3 fois pendant 5 min à chaque fois sur la coiffe.
- Rincer le tissu en utilisant des concentrations croissantes d'éthanol (30%, 50%, 75%, 85%, 95% et enfin 100%) pendant 15 min à chaque fois sur la coiffe.
4. Coupe transversale Préparation de la surface pour les SEM
- Transfert tissu dans 100% d'éthanol à un plat peu profond de Pétri contenant également 100% d'éthanol.
- Tenir deux lames de rasoir très pointus, tels que les méplats des côtés sont en contact les unes avec les autres et les arêtes de coupe transversale pour former deux côtés d'un triangle équilatéral au-dessus de l'échantillon. Pour ce faire, utiliser la main gauche pour placer une lame sur le côté droit de l'échantillon etcoupé vers la gauche. Dans le même temps, utiliser la main droite pour placer la deuxième lame à l'extrême gauche de l'échantillon et la tranche droite. Ainsi, les lames seront glissés les uns contre les autres dans des directions opposées pour faire une seule coupe lisse.
- Faites glisser les côtés plats de la lame contre l'autre pour faire une coupe très propre de l'échantillon avec un minimum de distorsion ou de force d'arrachement, exposant de préférence aussi grande surface que possible sans endommager l'échantillon.
- Répétez l'opération pour chaque échantillon afin d'exposer les plus propres possibles surfaces de section transversale pour examen dans le SEM.
5. Point critique Séchage (DPC) du tissu cardiaque
- Utilisez une spatule ou des pinces pour transférer le tissu sur le support du sèche-point critique (CPD) de l'échantillon, veiller à ce que le tissu reste dans 100% d'éthanol en tout temps. Assurez-vous que le support est immergé dans de l'éthanol et que le transfert est réalisé avec le tissu exposé à l'air pendant pas plus de quelques secondes.
- Actionner CPD par nousle manuel er pour terminer 3 purge-and-cycles de remplissage pour remplacer l'éthanol avec du dioxyde de carbone liquide.
- Actionner CPD par le manuel de l' utilisateur pour obtenir des points critiques séchage des échantillons et les retourner à la pression atmosphérique avec ventilation contrôlée de CO 2.
6. Montage de Specimens Coeur de tissus pour SEM
- Préparer un échantillon MEB pour chaque échantillon, en collant une étiquette autocollante de carbone à la surface supérieure de la fusée d'aluminium.
- Avec l'aide d'un stéréomicroscope, respecter scrupuleusement l'échantillon à l'onglet adhésif avec la surface de section transversale d'intérêt vers le haut (loin de l'onglet, visible), et aussi près que possible de parallèle avec le plan de la surface échantillon de moignon. Ne pas sonder ou de toucher la surface d'intérêt.
- Casser un applicateur bâton de bois pour obtenir une brosse conique, idéal pour l'application de peinture. Appliquer l'argent ou de la peinture de carbone à la base et les côtés de l'échantillon, pour améliorer l'adhérence au bout.
- Prolonger une ligne très mince d'argent ou de carbone peindre jusqu'à un bord de la surface d'intérêt, pour fournir un trajet de charge de la surface d'intérêt à la terre.
- Appliquer 2 ou 3 petites taches de peinture d'argent ou de carbone autour du périmètre de la languette de carbone, pour fournir un chemin conducteur à partir de la surface de patte de carbone dans l'embout métallique, et donc à la masse.
- Laisser la peinture conductrice à sécher pendant deux heures.
- Actionner pulvérisation coucheuse par le manuel de l'utilisateur d'appliquer un revêtement relativement lourd (plage cible de 30 - 40 nm) d'un alliage or-palladium ou de l'or. La chambre de pompe de l'échantillon à environ 0,1 mbar; régler la minuterie à 40 sec. Ouvrir le robinet de Set à 8:00 positions (débit de gaz Argon modérée). Appuyez sur Start pour lancer revêtement par pulvérisation à 30 mA. décharge luminescente Violet doit être visible dans la chambre d'échantillon.
7. SEM L'examen des échantillons de tissus cardiaques
- Effectuer microscopie électronique à balayage à relativement basse tension d'accélération pour minimiser l'imagerie problèmes associés à une mauvaise dissipation de charge dans l'échantillon (en charge). condition d'image initiale suggérée sont: 5 kV tension d'accélération, 10 mm distance de travail.
- Avec l'aide d'un opérateur expérimenté, emploi a augmenté la distance de travail pour étendre la profondeur de champ dans des conditions d'imagerie nécessitent l'attention de fibres dans de multiples plans focaux, ou des fibres prorogeant pour une longueur considérable dans la dimension z.
- Pour le microscope utilisé ici (voir le tableau des matériaux), dans l'accès à l'interface utilisateur de l'onglet de navigation en haut à droite.
- Accédez à l'onglet Coordonnées dans le menu de la scène. Pour augmenter la distance de travail, entrez une valeur supérieure en millimètres pour la coordonnée Z puis cliquez sur le Aller à onglet pour déplacer la platine d'échantillon à la distance de travail est entré.
- Avec l'aide d'un opérateur expérimenté, employer spécimen inclinaison et rotation pour positionner la surface d'intérêt orthogonale au faisceau d'électrons. inclinaison supplémentaire de 10 à 30 degrees de cette position peut améliorer l'observation et la documentation de la structure de la matrice.
- Pour le microscope utilisé ici (voir le tableau des matériaux), dans l'interface utilisateur, cliquez et maintenez le bouton droit de la souris, puis faites glisser à gauche ou à droite pour concentrer l'échantillon près de la périphérie du plan de surface préparée d'intérêt, notant la distance de travail focalisé .
- Naviguer avec le Manuel Interface utilisateur joystick pour se déplacer près du bord opposé de la surface et répétez le focus. Si la distance de travail ne sont pas à peu près égale à la première position, l'échantillon d'inclinaison pour parvenir à un accord approximatif aux deux endroits en utilisant l'onglet Coordonnées du menu de la scène (voir 7.2) et entrez une valeur d'inclinaison dans le T de coordonnées.
- Tournez spécimen quatre-vingt dix degrés (entrer la valeur en R champ Coordinate) et répétez le processus jusqu'à ce que tous les postes sont concentrés à environ la même distance de travail.
Remarque: la pression variable SEM peut être utilisé pour améliorer la dissipation de chargesi disponible. Vide élevé est le mode de fonctionnement standard pour la microscopie électronique à balayage.
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Representative Results
La technique mise en évidence a été appliquée aux tissus cardiaques à partir d' un donneur de greffe de cœur humain utilisé (Figure 1), les tissus explantées de receveurs de greffe, des cœurs de type sauvage et souris dystrophique (Figure 3), et post-myocardique échantillons cardiaques infarctus d'un porcine modèle de lésion cardiaque (Figure 2). Comme on le voit sur la figure 1, la matrice cardiaque humain est un tissu complexe de protéines réticulées qui présentent un motif en nid d'abeilles vu en coupe transversale. Chaque structure «nid d'abeille» est d' environ 40 m de large, contournant normalement une seule myocytes, lors de l' examen de la vue en plan sur la figure 1. Lorsqu'il est connecté par des disques intercalés, plusieurs cardiomyocytes peut être envisagé comme une tige en cours d' exécution de la longueur à travers le «tunnel» quand la métaphore est étendue à la tridimensionnalité. Figure 1 aussi les faits saillantsl'importance de la procédure de coupe, avec une plus grande précision donnant des données topographiques plus révélateurs (Figure 1, en haut à gauche) que les sections qui sont "fracassé" pendant le processus de coupe (Figure 1, en haut à droite).
L'élimination des cellules résidentes cardiaques, des vaisseaux sanguins et des cellules vasculaires avant le traitement MEB révèle des détails ultra-structurelles supplémentaires qui seraient moins sensibles par MEB des blocs de tissu cardiaque entier. Chaque "entretoise" individu collagénique, par exemple (Figure 1, panneau inférieur) est apparemment alignés à des intervalles réguliers et perpendiculaires aux myofibrilles sarcomères. Cet arrangement est approprié pour aider à maintenir la structure du cœur par des déformations de contre-action exercées au cours des cycles de contraction et de relaxation, similaire à la «chaîne et trame» de textiles qui aide à maintenir le corps en tissu et la forme contre l'étirement.
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Figure 1:. Représentant analyse au microscope électronique de l'arrangement en trois dimensions de la matrice extracellulaire dans décellularisé Left Ventricular tissu obtenu à partir d' un non utilisé coeur du donneur humain Les deux panneaux supérieurs montrent la matrice en coupe à faible grossissement (barres = 500 um), offrant une vue aérienne de l'architecture du tissu normal du cœur humain. A plus fort grossissement, on peut mieux observer la structure typique en nid d'abeilles de fibres de soutien qui fournissent un soutien mécanique pour myofibres régulièrement espacées (barres de panneau gauche et à droite du milieu = 100 um et 50 um, respectivement). Lors de l'inspection de plus près, chaque «nid d'abeille» est composé de fibres qui sont organisées en parallèle avec l'autre tout en perpendiculaire à cardiomyocytes résidents (barres de panneau en bas à gauche et à droite = 10 um et 5 um, respectivement).TTPs: //www.jove.com/files/ftp_upload/54005/54005fig1large.jpg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
En plus de fournir des informations structurelles, SEM des tissus décellularisé peut permettre une évaluation significative, qualitative des changements de la matrice extracellulaire en réponse à une blessure ou des formes non dommageables de cardiomyopathie. Par exemple, cette technique a récemment été utilisée pour examiner les matrices extracellulaires des tissus cardiaques de porcs post-infarctus 43. Au cours de cette expérience grand animal, conçu spécifiquement pour évaluer l'efficacité de l'isoforme GGF2 de NRG-1β comme un potentiel thérapeutique de l'insuffisance cardiaque, les porcs post-infarctus qui a reçu l'administration intraveineuse NRG-1β affichés les frappant des altérations de la matrice cardiaque , par rapport aux tissus cardiaques non traités des animaux post-infarctus. Ces résultats ont été publiés ultérieurement 43, et technique est resté un outil précieux pour la construction sur ce, découverte fortuite initiale. La figure 2 comprend par exemple des micrographies, produites au cours de cette étude, qui mettent en évidence les différences de matrice drastiques entre matrices non traitées et NRG-1β-traités.
Figure 2:. Représentant électronique à balayage micrographies de ventricule gauche matrice extracellulaire dans Pigs -Traité non traités et NRG-1 β, après NaOH Macération La matrice en coupe met en évidence la disposition spatiale régulière de fibres dans non traité post-infarctus du myocarde (post-MI) porcs (en haut à gauche), par rapport aux animaux post-MI NRG-1β-traitée (en haut à droite). Vu dans la longitude, la matrice non traitée chez le porc présente un aspect épais, mat analogue (en bas à gauche), tandis que la matrice de NRG-1 ß traitées porcsaffiche arrangement spatial régulier des fibres (en bas à droite). bar blanc = 40 pm (tous les quatre panneaux). Résultats et chiffres plus détaillés sont inclus dans le manuscrit associé 43. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Exploration des changements de la matrice qui se produisent dans les cœurs dystrophiques a également donné des informations qualitatives sur la progression et le développement d'un modèle animal de Duchenne cardiomyopathie Duchenne (DMD). Chez la souris mdx, un modèle de souris couramment utilisée de DMD, il existe des différences importantes et dépendant de l' âge chez de type sauvage et les cœurs mdx lorsque vu par SEM après fixation et le traitement NaOH. Comme on le voit sur la figure 3, les composants de la matrice sont relativement normale âgées de 6 semaines coeurs mdx dépourvus dystrophine fonctionnelle par rapport aux souris normales. Plus interesting, l' organisation de la matrice extracellulaire a été clairement perturbé ou peut - être dégradée chez les souris déficientes en dystrophine âgées par rapport à des souris mdx plus jeunes, illustrant la nature progressive de la DMD dans le cœur. Ces différences profondes ne devaient pas, parce que les souris mdx sont mal représentatives de la cardiomyopathie DMD humaine en raison du fait qu'ils présentent un phénotype de cardiomyopathie beaucoup plus doux et le taux de mortalité plus lent que les humains atteints de DMD 48. Ceci suggère que même de petits changements dans la fonction cardiaque peuvent être capturées en utilisant la technique de visualisation présenté dans ce manuscrit. Cette méthodologie devrait également être facilement adaptable aux matrices extracellulaires d'autres organes, pour lesquels il n'y a pas non plus actuellement disponibles thérapies de fibrose-ciblage.
Figure 3: Représentant électronique à balayage micrographies de gauche Ventricular matrice extracellulaire dans le type sauvage par rapport à des souris mdx. La matrice du ventricule gauche cardiaque chez les souris de type sauvage (panneau supérieur) est similaire à celle observée chez d' autres espèces. La matrice chez les souris mdx à 6 semaines d'âge semble relativement normal, bien que légèrement "fluffy" en apparence (panneau du milieu). A l' inverse, la matrice cardiaque des souris mdx âgées apparaît fortement dégénéré (panneau inférieur), indiquant que le processus dystrophique peut être capturé qualitativement en utilisant SEM dans les tissus, NaOH-macérés fixes. Blanc bar = 10 pm (tous les trois panneaux). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Cross préparation section de surface est l'étape la plus critique au cours du protocole. Afin de préserver la structure fine, les échantillons déshydratés doivent rester en éthanol à 100% en tout temps jusqu'à introduit dans le processus de séchage au point critique. Par conséquent, le découpage des échantillons pour réaliser des surfaces d'examen EM doivent être effectués alors que les échantillons sont immergés dans de l'éthanol dans un plat peu profond. Il est également essentiel que la surface exposée ne soit pas touché ou sondé lors des manipulations ultérieures. Aucune modification majeure sont prévues pour l'application de cette technique à d'autres types de tissus pour les observations de matrice similaires, bien que la partie SEM du protocole pourrait nécessiter de base microscopie électronique dépannage sans distinction d'origine échantillon. Images collectées à partir des échantillons fibreux sont sujettes à des artefacts introduits par une mauvaise dissipation responsable ( "charge"). problèmes de charge peuvent généralement être réduites en réduisant la tension d'accélération, ce qui augmente la vitesse de balayage (également appelé temps de séjour) Et en réduisant la taille du spot du faisceau d'électrons. L'intégration de plusieurs balayages recueilli assez rapidement pour éviter les artefacts de charge va produire une image d'un signal comparable à la qualité du bruit sans les artefacts de charge présents dans une unique image de balayage plus lent de qualité supérieure.
Cette technique est par nature qualitative et complète lorsqu'elle est considérée aux côtés des mesures quantitatives (par exemple, le trichrome de Masson ou picoserius coloration rouge, mesure de la teneur en hydroxyproline, la spectrométrie de masse et de RNA-seq) pour déterminer comment les différences structurelles visualisées pourraient être liées à divers états de développement ou de la maladie ainsi. Cependant, en dépit de cette limitation, la méthode est importante au-delà de la fibrose cardiaque spécifiquement, parce que la matrice extracellulaire est une composante essentielle de presque tous les organes du corps. Dans le cœur, la matrice cardiaque fournit un support mécanique critique pour le pompage continu caractérisé par le complexe d'étirement, la torsion, et deformation, qui confère l' entrée optimale et efflux de sang oxygéné et désoxygéné 49 pour les> 2,5 milliards de battements qui se produisent au cours de la durée de vie humaine moyenne. Compte tenu de la très faible capacité de régénération du tissu cardiaque, une matrice dynamique qui peut être remodelé en fonction des besoins contextuels est logique. Avec seulement un léger étirement de l'imagination, on pourrait en déduire qu'il existe des cibles thérapeutiques pour la manipulation de remodelage de la matrice pour améliorer le processus de guérison, tout en limitant la fibrose indésirable. Application de la technique démontrée au minimum met en valeur la sophistication et la beauté de la matrice cardiaque et, ce faisant, souligne encore son importance fonctionnelle.
Alors que la valeur des mesures quantitatives est un principe de base pour l'évaluation de la quasi-totalité des études expérimentales, la technique a mis en évidence ici peut être utilisé pour révéler les variations ultrastructurales qualitatives qui complètent non seulement les mesures de la matrice standardsmais pourrait suggérer des chemins d'enquête alternatives pour comprendre les altérations biochimiques fondamentaux qui mettent en évidence les changements qualitatifs. applications futures attendues de cette technique sont son utilisation dans des modèles de maladies cardiaques et de tissus humains comme un outil complémentaire pour évaluer les changements de la matrice, ainsi que l'utilisation élargie pour étudier d'autres organes pour lesquels des modifications de la matrice sont une composante du processus de la maladie.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Calcium Chloride | Electron Microscopy Sciences | 12340 | 100 g |
| Carbon Adhesive | Electron Microscopy Sciences | 12664 | 30 g |
| Carbon Adhesive Tabs | Electron Microscopy Sciences | 77825 | order to fit stubs |
| Double Edge Razor Blades Stainless Steel | Ted Pella, Inc | 121-6 | 250/pkg |
| Ethanol | Electron Microscopy Sciences | 15055 | 450 ml |
| Gluteraldehyde, 50% Solution | Electron Microscopy Sciences | 16310 | EM grade, distillation purified |
| Hydrochloric Acid | Electron Microscopy Sciences | 16760 or 16770 | 100 ml |
| Monosodium Phosphate NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9251-250G | 250 g |
| Osmium Tetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19100 | 1 g |
| Silver Conductive Adhesive | Electron Microscopy Sciences | 12686-15 | 15 g |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | S8045-1KG | 1 kg |
| Sodium Phosphate Dibasic (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S3264-500G | 500 g |
| Tannic Acid, 5% Aqueous | Electron Microscopy Sciences | 21702-5 | 500 ml |
| Trihydrate Sodium Cacodylate | Electron Microscopy Sciences | 12300 | 100 g |
| Gold-palladium Alloy or Gold | Refining Systems, Inc. | varies | specific to the sputter coater make and model |
| Critical Point Dryer | Electron Microscopy Sciences | 850 | |
| Plain Wooden Applicators | Fisher Scientific | 23-400-102 | |
| Quanta 250 Environmental SEM | FEI | Q250 SEM | |
| Sputter Coater | Cressington Scientific Instruments Ltd. | Model 108 | |
| Alluminum SEM Sample Stubs | Electron Microscopy Sciences | 75220-12 | specific to the miscroscope |
References
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