ब्रेन स्लाइस में पूरे सेल पैच दबाना रिकॉर्डिंग
Summary
इस प्रोटोकॉल पूरे सेल पैच दबाना रिकॉर्डिंग के प्रदर्शन के लिए बुनियादी प्रक्रियात्मक चरणों का वर्णन है। इस तकनीक में न्यूरॉन्स की बिजली के व्यवहार के अध्ययन की अनुमति देता है, और जब मस्तिष्क के स्लाइस में प्रदर्शन किया, न्यूरॉन्स है कि अभी भी अपेक्षाकृत अच्छी तरह से संरक्षित मस्तिष्क सर्किट में एकीकृत कर रहे हैं से विभिन्न न्यूरोनल कार्यों के मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है।
Abstract
पूरे सेल पैच दबाना रिकॉर्डिंग एक electrophysiological तकनीक है कि न्यूरॉन का एक बड़ा हिस्सा बिजली के गुणों के अध्ययन की अनुमति देता है। इस विन्यास में, micropipette कोशिका झिल्ली, जो वर्तमान रिसाव पहले से इस्तेमाल किया intracellular तेज इलेक्ट्रोड रिकॉर्डिंग विधि से रोकता है और इस तरह प्रदान करता है और अधिक सटीक आयनिक वर्तमान माप के साथ तंग संपर्क में है। प्रतिष्ठित, पूरे सेल रिकॉर्डिंग की तैयारी के विभिन्न प्रकार, सेल संस्कृति मॉडल, अलग न्यूरॉन्स, मस्तिष्क स्लाइस में न्यूरॉन्स सहित में न्यूरॉन्स पर प्रदर्शन किया जा सकता है, और बरकरार anesthetized या जाग पशुओं में। सारांश में, इस तकनीक को बेहद उत्तेजनीय कोशिकाओं के निष्क्रिय और सक्रिय biophysical गुणों को समझने के लिए योगदान दिया है। इस तकनीक का एक प्रमुख लाभ यह है कि इस पर जानकारी प्रदान करता है कैसे विशिष्ट जोड़तोड़ (जैसे, औषधीय, प्रयोगकर्ता प्रेरित प्लास्टिसिटी) विशिष्ट neuronal कार्यों या सी को बदल सकता हैवास्तविक समय में hannels। इसके अतिरिक्त, प्लाज्मा झिल्ली के महत्वपूर्ण उद्घाटन आंतरिक पिपेट समाधान स्वतंत्र रूप से कोशिका द्रव्य में फैलाना, शुरू दवाओं, जैसे, एगोनिस्ट या विशिष्ट intracellular प्रोटीन के विरोधी के लिए साधन उपलब्ध कराने, और पड़ोसी कोशिकाओं में उनके कार्यों को बदलने के बिना इन लक्ष्यों को जोड़ तोड़ की अनुमति देता है। यह लेख पूरे सेल रिकॉर्डिंग पर ध्यान दिया जाएगा, एक तैयारी अपेक्षाकृत अच्छी तरह से संरक्षित मस्तिष्क सर्किट, अर्थात् में न्यूरॉन्स की रिकॉर्डिंग, एक physiologically प्रासंगिक संदर्भ में का लाभ दिया है कि मस्तिष्क के स्लाइस में न्यूरॉन्स पर प्रदर्शन किया। विशेष रूप से, जब उचित औषध विज्ञान के साथ संयुक्त, इस तकनीक को विशिष्ट neuroadaptations कि इस तरह की शिक्षा, दुरुपयोग की दवाओं के लिए जोखिम है, और तनाव के रूप में अनुभव है, के किसी भी प्रकार के बाद हुआ की पहचान की अनुमति के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। सारांश में, मस्तिष्क स्लाइस में पूरे सेल पैच दबाना रिकॉर्डिंग पूर्व vivo तैयारी लंबे समय से स्थायी परिवर्तन में मापने के साधन उपलब्ध करातेन्यूरोनल कार्यों में उस बरकरार जाग पशुओं में विकसित किया है।
Introduction
पैच दबाना तकनीक, एक electrophysiological तकनीक है कि 1970 के दशक 1,2 में विकसित किया गया है, जीने के ऊतकों में एक या कई आयन चैनल कार्यों के अध्ययन के लिए एक प्राथमिक उपकरण है। विभिन्न पैच विन्यास है कि प्राप्त किया जा सकता है के बीच, पूरे सेल पैच दबाना रिकॉर्डिंग न्यूरॉन का एक बड़ा हिस्सा के बिजली के व्यवहार के अध्ययन के लिए अनुमति देते हैं। प्रतिष्ठित, इस तकनीक इन विट्रो में या तो मस्तिष्क स्लाइस, हौसले से अलग न्यूरॉन्स पर, या सेल संस्कृति मॉडल 3 पर किया जाता है। जब दिमाग में न्यूरॉन्स स्लाइस पर प्रदर्शन किया, इस तकनीक के कई फायदे प्रस्तुत करता है। विशेष रूप से: (i) न्यूरॉन्स कुछ हद तक है कि अपेक्षाकृत संरक्षित मस्तिष्क सर्किट में दर्ज हैं, और सेल संस्कृति की तैयारी की तुलना में, एक वातावरण है कि physiologically प्रासंगिक 3 है प्रदान करते हैं। यह जल्दी कब्जा, या यहां तक कि वास्तविक समय में निगरानी, सेलुलर और आणविक घटनाओं है कि तीव्र Pharmacolog के किसी भी प्रकार से शुरू हो रहे अनुमति देता हैराजनैतिक जोड़तोड़ – एक अस्थायी समाधान है कि इन विवो परिस्थितियों में शास्त्रीय का उपयोग कर हासिल नहीं किया जा सकता है; (ii) की क्षमता नेत्रहीन मस्तिष्क स्लाइस में मस्तिष्क क्षेत्रों की पहचान करने के लिए दोनों जब वे फ्लोरोसेंट मार्करों व्यक्त मस्तिष्क क्षेत्र का अध्ययन करने के लिए और विशिष्ट न्यूरॉन्स के लिए उच्च क्षेत्रीय विशिष्टता 3 की अनुमति देता है; (iii) (intracellular रिकॉर्डिंग के लिए एक तेज micropipette के साथ झिल्ली puncturing के विपरीत) प्लाज्मा झिल्ली का एक महत्वपूर्ण भाग खोलने के द्वारा सेल के intracellular अंतरिक्ष के लिए उपयोग 4। बारी में, यह सामग्री या आंतरिक समाधान रचना विशिष्ट आयनों की एकाग्रता इसलिए आणविक लक्ष्यों को संशोधित किया जा करने के लिए या सेलुलर तंत्र अलग अलग परिस्थितियों में अध्ययन किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, पूरे सेल विन्यास, किसी भी विशिष्ट औषधीय एजेंट (जैसे, विरोधी) की स्थापना पर एक रिकॉर्डिंग micropipette (पैच पिपेट) समाधान सीधे कोशिका द्रव्य में फैलाना और उसके putat पर कार्य करेगा करने के लिए जोड़ सकते हैं किपड़ोसी कोशिकाओं में लक्ष्य समारोह बदलने के बिना intracellular लक्ष्यों ive। इसके अतिरिक्त, तेज micropipette रिकॉर्डिंग की तुलना में, पैच दबाना इलेक्ट्रोड की नोक पर बड़े खोलने कम प्रतिरोध, कम प्रतिस्पर्धा शोर, और सेल 4 के अंदर करने के लिए इस तरह बेहतर बिजली के पास हैं। हालांकि, उस पिपेट नोक पर बड़े खोलने सेल डायलिसिस के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, और इस तरह intracellular आणविक मशीनरी है कि जैविक घटना है कि अध्ययन 5,6 के तहत कर रहे हैं की अभिव्यक्ति के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है के नुकसान पर ध्यान दें। इस मामले में, तेज इलेक्ट्रोड रिकॉर्डिंग अधिक उपयुक्त हो सकता है। रिकॉर्डिंग इस प्रकार का एक ताकना कि, पूरे सेल रिकॉर्डिंग के लिए इस्तेमाल किया जिससे intracellular अंतरिक्ष और आंतरिक पिपेट समाधान के बीच आयन एक्सचेंज का सबसे रोकने उन लोगों की तुलना में काफी छोटा है साथ micropipettes की आवश्यकता है।
अनुभव (तीव्र या पुराना) का किसी भी रूप, सहित 7-10 दुरुपयोग 11,1 की दवाओं के लिए जोखिम सीखने,2, तनाव 13,14, आदि, विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्रों में neuronal समारोह के विभिन्न पहलुओं को बदल सकते हैं। क्योंकि इन परिवर्तनों अक्सर (दिनों घंटे) विकसित करने के लिए समय की आवश्यकता है, जानवरों से मस्तिष्क स्लाइस में पूरे सेल रिकॉर्डिंग है कि एक विशिष्ट अनुभव से गुजरा है शोधकर्ताओं ने इन परिवर्तनों की पहचान करने की अनुमति देते हैं। असल में, कई (यदि सभी नहीं) घटक है कि न्यूरोनल कार्य (जैसे, ligand सक्रिय आयन चैनल, वोल्टेज-गेटेड आयन चैनल, न्यूरोट्रांसमीटर ट्रांसपोर्टरों), और इस तरह मस्तिष्क सर्किट गतिविधि और व्यवहार, अनुभव से बदला जा सकता है (अनुभव पर निर्भर में भाग लेने प्लास्टिसिटी) 10,15-17। न्यूरोनल स्तर पर, मस्तिष्क सर्किट गतिविधि synaptic के बीच लगातार बातचीत (जैसे, ग्लूटामेट संचरण) और आंतरिक सेलुलर excitability कारकों (जैसे, axosomato-वृक्ष के समान आयन चैनल से उभर रहे हैं: पोटेशियम, K +, सोडियम, ना + और कैल्शियम, सीए 2 )। Whol का उपयोग कर विशेष परिस्थितियों मेंई-सेल पैच दबाना electrophysiological तकनीक, synaptic बनाम आंतरिक excitability में परिवर्तन से होने वाले विशेष रूप से संकेत परिवर्तन अलग किया जा सकता है।
ज्यादातर मामलों में, synaptic excitability पूरे सेल वोल्टेज दबाना तकनीक का उपयोग कर मूल्यांकन किया है। यह रिकॉर्डिंग मोड आयन धाराओं [जैसे, α अमीनो-3-हाइड्रोक्सी-5-मिथाइल-4-isoxazolepropionic एसिड रिसेप्टर्स द्वारा मध्यस्थता की माप (अनुमति देता है AMPA रिसेप्टर्स) और एन मिथाइल-डी aspartic एसिड रिसेप्टर्स (NMDA रिसेप्टर्स)] न्यूरोनल प्लाज्मा झिल्ली के माध्यम से एक सेट वोल्टेज पर झिल्ली क्षमता धारण करते हुए। इधर, प्रयोगकर्ताओं आंतरिक micropipette समाधान है कि सीज़ियम होते हैं (सीएस +), कश्मीर + चैनलों की एक व्यापक अवरोधक (कुंजी आंतरिक excitability कारकों) का उपयोग करें। पूरे सेल विन्यास की स्थापना करने पर, intracellular अंतरिक्ष में सीएस + के प्रसार कश्मीर + चैनलों रोकेंगे, और इस तरह दोनों एक अपेक्षाकृत कुशल अंतरिक्ष दबाना और पूर्व अनुमति देगाअन्य मापन पर आंतरिक excitability कारकों के प्रभाव वेंट। अंतरिक्ष दबाना मुद्दों, यानी, पूरे सेल वोल्टेज दबाना करने के लिए कठिनाई, उठता है कि जब अनियमित आकार की कोशिकाओं (जैसे, न्यूरॉन्स), और विशेष रूप से 18,19 कुंज एक विशाल और जटिल वृक्ष के समान के साथ न्यूरॉन्स रिकॉर्डिंग। क्योंकि दैहिक वोल्टेज क्लैंप खराब नियंत्रण न्यूरॉन्स के वृक्ष के समान पेड़ में वोल्टेज, अध्ययन के तहत वृक्ष के समान विद्युत संकेतों के विभिन्न पहलुओं को एक वृक्ष के समान दूरी पर निर्भर ढंग से विकृत कर रहे हैं। (कृत्रिम Cerebro-रीढ़ की हड्डी में तरल पदार्थ, ACSF) ऐसे picrotoxin (गामा aminobutyric एसिड, गाबा एक रिसेप्टर प्रतिपक्षी) या kynurenic एसिड (ग्लूटामेट रिसेप्टर्स की व्यापक अवरोधक) के रूप में औषधीय उपकरण कोशिकी समाधान में भंग के साथ संयुक्त, इस तकनीक ग्लूटामेट की माप की अनुमति देता है receptor- और क्रमश: गाबा ए आर मध्यस्थता धाराओं।
इसके विपरीत, आंतरिक excitability आमतौर पर वर्तमान दबाना रिकॉर्डिंग मोड में मूल्यांकन किया है।के रूप में वोल्टेज दबाना रिकॉर्डिंग करने का विरोध किया, इस रिकॉर्डिंग मोड न्यूरोनल प्लाज्मा झिल्ली के माध्यम से बह आयन धाराओं से प्रेरित झिल्ली क्षमता में बदलाव की माप की अनुमति देता है। आमतौर पर, आंतरिक excitability में परिवर्तन न्यूरॉन्स कार्रवाई की क्षमता है, जो दोनों ना + और कश्मीर + चैनलों की आवश्यकता उत्पन्न करने के लिए क्षमता में परिवर्तन के माध्यम से मूल्यांकन किया है। इसलिए, जब वर्तमान दबाना रिकॉर्डिंग प्रदर्शन, micropipettes एक आंतरिक समाधान है कि कश्मीर + बजाय सीएस + शामिल है के साथ भर रहे हैं। औषधीय एजेंटों कि ग्लूटामेट और गाबा ब्लॉक एक रिसेप्टर की मध्यस्थता धाराओं ACSF में भंग के साथ संयुक्त, इस प्रयोगात्मक डिजाइन synaptic excitability में संभावित परिवर्तनों से दूषित किया जा रहा बिना neuronal फायरिंग के लिए आंतरिक कारकों (जैसे, कश्मीर + चैनल) के योगदान की माप की अनुमति देता है कारकों।
यह लेख बुनियादी आवश्यक प्रक्रियात्मक चरणों का वर्णन करेंगे टीओ (i) स्वस्थ मस्तिष्क स्लाइस तैयार; (Ii) पूरे सेल विन्यास को प्राप्त करने, और (iii) synaptic और आंतरिक excitability आकलन करने के लिए बुनियादी मानकों की निगरानी।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल मस्तिष्क स्लाइस में न्यूरॉन्स पर पूरे सेल पैच दबाना प्रयोगों प्रदर्शन के लिए बुनियादी प्रक्रिया का वर्णन है। हालांकि, जटिलता, क्षमता और इस तकनीक की संवेदनशीलता को पूरी तरह से इस आलेख में…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस शोध केन्द्र शासित प्रदेशों के पश्चिमी स्टार्टअप फंड (एस) द्वारा समर्थित किया गया।
Materials
| Isolated pulse stimulus generator | A.M.P.I | Master-8 | |
| Isolation unit (ISO-Flex) | A.M.P.I | ISO-Flex | |
| Computer controlled Amplifier | Molecular Devices | Multiclamp 700B | |
| Digital Acquisition system | Molecular Devices | Digidata 1500 | |
| Microscope | Olympus | BX-51 | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-200 | |
| Chamber and in-line Heater | Warner Instruments | TC-344B | |
| Vibratome Slicer | Leica | VT1000 S | |
| Micropipette Puller | Narishige | PC-10 | |
| Imaging Camera | Q Imaging | QIClick-F-M-12 | |
| Narishige pipette puller PC-10 | Narishige | PC-10 | |
| Glass capillaries | WPI | TW150F-3 | |
| Slice hold-down (harp) | Warner Instruments | 64-0255 | |
| Slice Chamber | Warner Instruments | RC-26 | |
| Nonmetallic syringe needle | World Precision Instruments | MF28G67-5 | |
| Syringe filters | Nalgene | 176-0045 | |
| Glue Gun | Home Depot | various | |
| Gas dispersion tube | Ace Glass Inc. | various | |
| Decapitation scissors | Home Depot | 100649198 | |
| Scalpel Handle #3 | World Precision Instruments | 500236 | |
| Small straight sharp tips scissors | World Precision Instruments | 14218 | |
| Vessel canulation forceps | World Precision Instruments | 500453 | |
| Curved hemostatic forceps | World Precision Instruments | 501288 | |
| Economy Tweezers #3 | World Precision Instruments | 501976-6 | |
| Spatula | Fisher Scientific | 14357Q | |
| Scooping spatula | Fisher Scientific | 14-357Q | |
| Petri dish | Fisher Scientific | 08-747B | |
| Filter paper | Lab Depot | CFP1-110 | |
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions | |||
| Cs-Gluconate internal solution (pH 7.2–7.3, 280–290 mOsm) | |||
| D-gluconic acid 50% | Sigma Aldrich/various | G1951 | |
| Cesium-OH (CsOH) 50% | Sigma Aldrich/various | 232041 | |
| NaCl, 2.8 mM | Sigma Aldrich/various | S7653 | |
| HEPES, 20 mM | Sigma Aldrich/various | H3375 | |
| EGTA, 0.4 mM | Sigma Aldrich/various | E4378 | |
| tetraethylammonium-Cl, 5 mM | Sigma Aldrich/various | T2265 | |
| Na2GTP, 0.3 mM | Sigma Aldrich/various | G8877 | |
| MgATP, 2 mM | Sigma Aldrich/various | A9187 | |
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
| K-Gluconate internal solution (pH 7.2–7.3, 280–290 mOsm) | |||
| K D-gluconate, 120 mM | Sigma Aldrich/various | G4500 | |
| KCl, 20 mM | Sigma Aldrich/various | P3911 | |
| HEPES, 10 mM | Sigma Aldrich/various | H3375 | |
| EGTA, 0.2 mM | Sigma Aldrich/various | E4378 | |
| MgCl2 | Sigma Aldrich/various | M8266 | |
| Na2GTP, 0.3 mM | Sigma Aldrich/various | G8877 | |
| MgATP, 2 mM | Sigma Aldrich/various | A9187 | |
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
| Standard artificial cerebrospinal fluid (ACSF, osmolarity ≈ 300-310 mOsm) | |||
| KCl, 2.5 mM | Sigma Aldrich/various | P3911 | |
| NaCl, 119 mM | Sigma Aldrich/various | S7653 | |
| NaH2PO4-H20, 1 mM | Sigma Aldrich/various | S9638 | |
| NaHCO3, 26.2 mM | Sigma Aldrich/various | S8875 | |
| Glucose, 11 mM | Sigma Aldrich/various | G8270 | |
| MgSO4-7H2O, 1.3 mM | Sigma Aldrich/various | 230391 | |
| CaCl2-2H20, 2.5 mM | Sigma Aldrich/various | C3881 | |
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
| Additional compounds used for solutions preparation | |||
| KOH | various | ||
| Kynurenic acid | Sigma Aldrich/various | K3375 | |
References
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