Isolasjon og profilering av mikroRNA holdig Exosomes fra Menneskelig Bile

Summary

Bile fluid is a valuable source of extracellular vesicles/exosomes that contain potentially important biomarkers. This protocol represents a robust method to isolate exosomes from human bile for further analyses including miRNA profiling.

Abstract

Exosome forskning i de siste tre årene har sterkt utvidet omfang mot identifisering og karakterisering av biomarkører og deres terapeutiske anvendelser.

Exosomes har nylig vist seg å inneholde microRNAs (Mirs). Mirs selv har oppstått som verdifulle biomarkører for diagnostiske formål. Som prøveinnsamling i klinikker og sykehus er ganske variabel, miRNA isolasjon fra hele galle varierer betydelig. For å oppnå robust, nøyaktige og reproduserbare miRNA profiler fra innsamlede galleprøver på en enkel måte krevde utvikling av en høy kvalitet protokoll for å isolere og karakterisere exosomes fra galle. Metoden krever flere sentrifugeringer og et filtreringstrinn med en endelig ultrasentrifuge trinn å pelletere de isolerte exosomes. Elektronmikroskopi, Western blot, flowcytometri og multi-parameter nanopartikkel optiske analyse, der det er tilgjengelig, er avgjørende karakterisering for å validere kvaliteten på exosomes. For isolering av miRNA fra disse exosomes, skyter lysatet med et ikke-spesifikt, syntetisk miRNA fra en art som Caenorhabditis elegans, dvs. Cel-MIR-39, er viktig for normalisering av RNA-ekstraksjon effektivitet. Isolasjon av exosome fra gallevæske følger denne metoden gjør det vellykkede miRNA profilering fra galle prøver lagret i flere år ved -80 ° C.

Introduction

Som andre biologiske væsker, dvs. morsmelk, plasma eller urin, inneholder galle exosomes, lipid rike vesikler ^1-4. Exosomes kan indusere eller endre biologiske funksjoner i mottakercellene ^{5, 6,} en form av celle-celle-kommunikasjon som kan være en del av deres normale funksjon ^{4, 7-9.} Exosomes kan inneholde miRNA arter som kan gi en verdifull kilde til biomarkører for diagnostisering ^10. mirnas profiler har fått betydelig oppmerksomhet de siste årene som diagnostiske og prognostiske markører for en rekke sykdommer ^11-14.

miRNA selv kan finnes i biologiske væsker, eventuelt utgitt av døde celler og mengden av skur celler kan bli sterkt påvirket av en underliggende sykdom. Den miRNA profilen til exosomes gjenspeiler ikke nødvendigvis miRNA profilen til den opprinnelige cellen ^{6, 10, 15-17,} men exosomes kan bære miRNA signaturer som kan være karakteristisk for foreldre cell liker en svulst celle. Tumor-avledet exosomes er blitt identifisert i plasma hos pasienter med lunge adenokarsinom, prostata kreft og andre tumorer ^{8, 16, 18.}

Målet med denne metoden er pålitelig og robust isolering av exosomes fra menneskelige galle prøver, i stor grad uavhengig av deres tidligere håndteringsprosedyrer. Det ble utviklet for å utnytte galle som en pålitelig kilde for miRNA for den potensielle diagnose av sykdommer i gallegangen som kolangiokarsinom ^19. Det består av flere trinn av sentrifugering med økende hastigheter for å isolere exosomes og kan være aktuelt for andre biologiske væsker.

Protocol

Innhenting av galle fra pasienter ved ercp (ERCP) krever godkjenning av et menneskelig fag studieprotokoll av Institutional Review Board. Alt arbeidet som presenteres her ble godkjent av Johns Hopkins University Institutional Review Board. 1. Exosome Isolasjon fra Bile Utfør ercp (ERCP). Plasser pasienten i liggende stilling og intubere. Passere en duodenoscope gjennom munnen til pasienten og sett den inn i den andre delen av tolvfingertarmen og identifisere de store pap…

Representative Results

Siden exosomes er for liten til å bli detektert ved vanlig mikroskopi eller flowcytometri, har elektronmikroskopi eller optisk analyse nanopartikler som skal utføres. Den nanopartikkel optisk analyse har den fordel i forhold til elektronmikroskopi at det er også kvantitativt og gir størrelsesfordeling og konsentrasjon. Instrumentet innfører en fint fokusert laserstråle gjennom et glassprisme inn i prøven. Den Brownske bevegelser av de isolerte vesikler fanges via en EMCCD høy fø…

Discussion

For å utnytte pålitelig exosomes isolert fra galle, er det viktig å anvende konsistent høy kvalitet isoleringsmetoder for å oppnå høy kvalitet på prøvene i retur. Metodikken er definert i denne artikkelen er en veletablert måte å isolere exosomes og miRNA fra menneskelige galle. Det fremhever flere viktige skritt i karakterisering av isolerte exosomes som et minimum skal omfatte elektronmikroskopi eller nanopartikkel optisk analyse og Western blot.

Det mest avgjørende skritt i is…

Materials

0.2µm Polyethersulfone (PES) membrane filter	Corning	431229
thinwall polyallomer ultracentrifuge tubes	Beckman Coulter	331374
SW40Ti rotor	Beckman Coulter
LM10-HS	Nanosight
Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) software	Nanosight
mirVANA	Life Technologies	AM1560
cOmplete Protease Inhibitor	Roche distributed by Sigma-Aldrich	4693116001
Immobilon PSQ	Millipore, Bedford MA	ISEQ00010
Anti-CD63 antibody	Abcam	ab59479
Anti-Tsg101	Abcam	ab30871