בידוד Profiling של MicroRNA המכיל Exosomes מן האדם מר
Summary
Bile fluid is a valuable source of extracellular vesicles/exosomes that contain potentially important biomarkers. This protocol represents a robust method to isolate exosomes from human bile for further analyses including miRNA profiling.
Abstract
מחקר Exosome בשלוש השנים האחרונות הרחיב מאוד את ההיקף לקראת זיהוי ואפיון של סמנים ביולוגיים והשימושים הטיפוליים שלהם.
Exosomes הוכחו לאחרונה להכיל מיקרו-רנ"א (מירס). מירס עצמם שהתעורר כסמנים ביולוגיים חשובים למטרות אבחון. כמו אוסף דגימה הניתנות במרפאות ובבתי חולים משתנה מאוד, בידוד מירנה מן המרה כולו משתנה באופן משמעותי. כדי להשיג פרופילים מירנה חזקים, מדויקים לשחזור ממדגמים מרים שנאספו בצורה פשוטה הנדרש לפיתוח פרוטוקול באיכות גבוהה לבודדים ולאפיין exosomes מן המרה. השיטה מחייבת מספר centrifugations וצעד סינון עם צעד ultracentrifugation סופי כדי גלול exosomes המבודד. מיקרוסקופי אלקטרונים, כתמים מערביים, cytometry זרימה וניתוח אופטי ננו-חלקיקים רב-פרמטר, הדבר אפשרי, הם צעדי אפיון חיוניים כדי לאמת את איכות exosomes. עבור הבידוד של מירנה מן exosomes אלה, תוקע את lysate עם מירנה שאינו ספציפי, סינטטי מזן כמו elegans Caenorhabditis, כלומר, Cel-miR-39, חשובים לנורמליזציה של יעילות מיצוי RNA. בידודו של exosome מנוזל המרה הבא שיטה זו מאפשר מירנה המוצלחת פרופיל ממדגמים מרים מאוחסנים במשך מספר שנים ב -80 מעלות צלזיוס.
Introduction
כמו נוזלים ביולוגיים אחרים, כלומר, חלב אם, פלזמה או שתן, מרה מכילה exosomes, שלפוחית עשירה שומנים 1-4. Exosomes יכול לגרום או לשנות תפקודים ביולוגיים בתאי נמען 5, 6, צורה של תקשורת בין תאים שעלול להיות חלק התפקוד התקין שלהם 4, 7-9. Exosomes יכול להכיל מיני מירנה אשר יכול לספק מקור חשוב של סמנים ביולוגיים לאבחון 10. פרופילים miRNAs שלנו זכו לתשומת לב משמעותית בשנים האחרונות כסמנים דיאגנוסטיים ופרוגנוסטיים עבור מגוון רחב של מחלות 11-14.
ניתן למצוא מירנה עצמה נוזלים ביולוגיים, ואולי שפורסמו על ידי תאים מתים ואת כמות התאים המחסן יכול להיות מושפע במידה רבה על ידי המחלה הבסיסית. הפרופיל מירנה של exosomes אינו משקף בהכרח את פרופיל מירנה של שמקורם בתא 6, 10, 15-17, עדיין exosomes עשוי לשאת חתימות מירנה שעשויה להיות מאפיין עבור ce ההוריתll כמו תאים סרטניים. Exosomes הנגזרות גידול זוהתה בפלזמה של חולים עם אדנוקרצינומה ריאות, סרטן הערמונית וגידולים אחרים 8, 16, 18.
המטרה של שיטה זו היא הבידוד האמין ויציב של exosomes דגימות מרת אדם, בלתי תלויות בעיקרם כיצד לטפל בדבר ומראש. הוא פותח כדי לנצל מרה כמקור אמין של מירנה לאבחון פוטנציאל של מחלות של צינור המרה כגון בכיס המרה 19. זה מורכב של מספר שלבים של צנטריפוגה עם הגדלת מהירויות לבודד exosomes ו שעשויים לחול על נוזלים ביולוגיים אחרים.
Protocol
Representative Results
Discussion
כדי לנצל exosomes מבודד באופן אמין מר, חשוב לנקוט אמצעי בידוד באיכות גבוהה ועקבי להשיג דגימות באיכות גבוהות בתמורה. המתודולוגיה המוגדר במאמר זה הוא דרך ומבוססת לבודד exosomes ו מירנה מן מרת אדם. זה מדגיש כמה צעדים מכריעים באפיון exosomes המבודד אשר לכל הפחות צריך מהווה במיקרוסקו…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was supported by a K08 Award (DK090154-01) from the National Institutes of Health (NIH; to F.M.S.).
Materials
| 0.2µm Polyethersulfone (PES) membrane filter | Corning | 431229 | |
| thinwall polyallomer ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 331374 | |
| SW40Ti rotor | Beckman Coulter | ||
| LM10-HS | Nanosight | ||
| Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) software | Nanosight | ||
| mirVANA | Life Technologies | AM1560 | |
| cOmplete Protease Inhibitor | Roche distributed by Sigma-Aldrich | 4693116001 | |
| Immobilon PSQ | Millipore, Bedford MA | ISEQ00010 | |
| Anti-CD63 antibody | Abcam | ab59479 | |
| Anti-Tsg101 | Abcam | ab30871 |
References
- Admyre, C., et al. Exosomes with immune modulatory features are present in human breast milk. J. Immunol. 179 (3), 1969-1978 (2007).
- Aushev, V. N., et al. Comparisons of microRNA patterns in plasma before and after tumor removal reveal new biomarkers of lung squamous cell carcinoma. PLoS One. 8 (10), e78649 (2013).
- Ben-Dov, I. Z., et al. Urine microRNA as potential biomarkers of autosomal dominant polycystic kidney disease progression: description of miRNA profiles at baseline. PLoS One. 9 (1), e86856 (2014).
- Vlassov, A. V., Magdaleno, S., Setterquist, R., Conrad, R. Exosomes: current knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials. Biochim. Biophys. Acta. 1820 (7), 940-948 (2012).
- Kosaka, N., Iguchi, H., Yoshioka, Y., Takeshita, F., Matsuki, Y., Ochiya, T. Secretory mechanisms and intercellular transfer of microRNAs in living cells. J. Biol. Chem. 285 (23), 17442-17452 (2010).
- Mittelbrunn, M., et al. Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomes from T cells to antigen-presenting cells. Nat. Commun. 2, 282 (2011).
- Pegtel, D. M., van de Garde, M. D., Middeldorp, J. M. Viral miRNAs exploiting the endosomal-exosomal pathway for intercellular cross-talk and immune evasion. Biochim. Biophys. Acta. 1809 (11-12), 715-721 (2011).
- Peinado, H., et al. Melanoma exosomes educate bone marrow progenitor cells toward a pro-metastatic phenotype through MET. Nat. Med. 18 (6), 883-891 (2012).
- Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nat. Rev. Immunol. 9 (8), 581-593 (2009).
- Valadi, H., Ekstrom, K., Bossios, A., Sjostrand, M., Lee, J. J., Lotvall, J. O. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nat. Cell Biol. 9 (6), 654-659 (2007).
- Bessho, K., et al. Integrative genomics identifies candidate microRNAs for pathogenesis of experimental biliary atresia. BMC Syst. Biol. 7, (2013).
- Calin, G. A., et al. MicroRNA profiling reveals distinct signatures in B cell chronic lymphocytic leukemias. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (32), 11755-11760 (2004).
- Collins, A. L., et al. A differential microRNA profile distinguishes cholangiocarcinoma from pancreatic adenocarcinoma. Ann. Surg. Oncol. 21 (1), 133-138 (2014).
- He, L., et al. A microRNA polycistron as a potential human oncogene. Nature. 435 (7043), 828-833 (2005).
- Taylor, D. D., Gercel-Taylor, C. MicroRNA signatures of tumor-derived exosomes as diagnostic biomarkers of ovarian cancer. Gynecol. Oncol. 110 (1), 13-21 (2008).
- Rabinowits, G., Gercel-Taylor, C., Day, J. M., Taylor, D. D., Kloecker, G. H. Exosomal microRNA: a diagnostic marker for lung cancer. Clin. Lung Cancer. 10 (1), 42-46 (2009).
- Skog, J., et al. Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers. Nat.Cell Biol. 10 (12), 1470-1476 (2008).
- Lance, R. S., Drake, R. R., Troyer, D. A. Multiple recognition assay reveals prostasomes as promising plasma biomarkers for prostate cancer. Expert Rev. Anticancer Ther. 11 (9), 1341-1343 (2011).
- Li, L., et al. Human bile contains microRNA-laden extracellular vesicles that can be used for cholangiocarcinoma diagnosis. Hepatology. 60 (3), 896-907 (2014).
- Gabriel, D. A., Giordano, K. Microparticle sizing and counting using light scattering methods. Semin. Thromb. Hemost. 36 (8), 824-832 (2010).
- Colombo, M., Raposo, G., Thery, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 30, 255-289 (2014).
