Isolering og Profilering af MicroRNA-holdige Exosomer fra human Bile
Summary
Bile fluid is a valuable source of extracellular vesicles/exosomes that contain potentially important biomarkers. This protocol represents a robust method to isolate exosomes from human bile for further analyses including miRNA profiling.
Abstract
Exosome forskning i de sidste tre år har i høj grad udvidet mod identifikation og karakterisering af biomarkører og deres terapeutiske anvendelser.
Exosomer er for nylig blevet vist at indeholde microRNA (Mirs). Mirs selv er opstået som værdifulde biomarkører for diagnostiske formål. Som prøvetagning i klinikker og hospitaler er ganske variabel, miRNA isolation fra hele galde varierer betydeligt. For at opnå solide, præcise og reproducerbare miRNA profiler fra indsamlede galde prøver på en enkel måde skal der udvikles en høj kvalitet protokol at isolere og karakterisere exosomer fra galden. Fremgangsmåden kræver flere centrifugeringer og et filtreringstrin med en endelig ultracentrifugeringstrin at pelletere de isolerede exosomer. Elektronmikroskopi, Western blots, flowcytometri og multi-parameter nanopartikler optisk analyse, hvor det er muligt, er afgørende karakterisering skridt til at validere kvaliteten af exosomes. Til isoleringen af miRNA fra disse exosomer, spiking lysatet med en ikke-specifik, syntetisk miRNA fra en art som Caenorhabditis elegans, dvs., Cel-MIR-39, er vigtig for normalisering af RNA ekstraktion. Isoleringen af exosom fra galde væske følger denne fremgangsmåde tillader vellykket miRNA profilering fra galde prøver opbevaret i flere år ved -80 ° C.
Introduction
Ligesom andre biologiske væsker, dvs modermælk, plasma eller urin, galde indeholder exosomer, lipid rige vesikler 1-4. Exosomer kan fremkalde eller ændre biologiske funktioner i modtagerlandene celler 5, 6, en form for celle-celle kommunikation, som kan være en del af deres normale funktion 4, 7-9. Exosomer kan indeholde miRNA arter, som kan give en værdifuld kilde til biomarkører til diagnosticering 10. miRNA profiler har fået betydelig opmærksomhed i de senere år som diagnostiske og prognostiske markører for en række sygdomme 11-14.
miRNA selv findes i biologiske væsker, eventuelt frigives af døde celler og mængden af stald celler kan blive kraftigt påvirket af en underliggende sygdom. Den miRNA profil exosomer ikke nødvendigvis afspejler miRNA profilen af cellen oprindelse 6, 10, 15-17, men exosomer kan bære miRNA signaturer, der kan være karakteristisk for forældrenes cell gerne en tumor celle. Tumorafledte exosomer er blevet identificeret i plasmaet fra patienter med lunge-adenocarcinom, prostata- og andre tumorer 8, 16, 18.
Målet med denne metode er pålidelig og robust isolering af exosomer fra humane galde prøver, stort set uafhængig af deres procedurer forudgående håndtering. Det blev udviklet til at udnytte galde som en pålidelig kilde til miRNA for den potentielle diagnosticering af sygdomme i galdegangen såsom cholangiocarcinom 19. Det består af flere trin i centrifugering med stigende hastigheder for at isolere exosomer og kan være gældende for andre biologiske væsker.
Protocol
Representative Results
Discussion
Til pålideligt udnytte exosomer isoleret fra galde, er det vigtigt at anvende en ensartet høj kvalitet isoleringsmetoder at få prøver af høj kvalitet til gengæld. Den metode, som fastlægges i dette papir er en veletableret måde at isolere exosomer og miRNA fra menneskelig galde. Det fremhæver flere afgørende skridt på karakterisering af isolerede exosomer der som minimum bør omfatte elektronmikroskopi eller nanopartikel optisk analyse og Western blotting.
Det mest afgørende skri…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was supported by a K08 Award (DK090154-01) from the National Institutes of Health (NIH; to F.M.S.).
Materials
| 0.2µm Polyethersulfone (PES) membrane filter | Corning | 431229 | |
| thinwall polyallomer ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 331374 | |
| SW40Ti rotor | Beckman Coulter | ||
| LM10-HS | Nanosight | ||
| Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) software | Nanosight | ||
| mirVANA | Life Technologies | AM1560 | |
| cOmplete Protease Inhibitor | Roche distributed by Sigma-Aldrich | 4693116001 | |
| Immobilon PSQ | Millipore, Bedford MA | ISEQ00010 | |
| Anti-CD63 antibody | Abcam | ab59479 | |
| Anti-Tsg101 | Abcam | ab30871 |
References
- Admyre, C., et al. Exosomes with immune modulatory features are present in human breast milk. J. Immunol. 179 (3), 1969-1978 (2007).
- Aushev, V. N., et al. Comparisons of microRNA patterns in plasma before and after tumor removal reveal new biomarkers of lung squamous cell carcinoma. PLoS One. 8 (10), e78649 (2013).
- Ben-Dov, I. Z., et al. Urine microRNA as potential biomarkers of autosomal dominant polycystic kidney disease progression: description of miRNA profiles at baseline. PLoS One. 9 (1), e86856 (2014).
- Vlassov, A. V., Magdaleno, S., Setterquist, R., Conrad, R. Exosomes: current knowledge of their composition, biological functions, and diagnostic and therapeutic potentials. Biochim. Biophys. Acta. 1820 (7), 940-948 (2012).
- Kosaka, N., Iguchi, H., Yoshioka, Y., Takeshita, F., Matsuki, Y., Ochiya, T. Secretory mechanisms and intercellular transfer of microRNAs in living cells. J. Biol. Chem. 285 (23), 17442-17452 (2010).
- Mittelbrunn, M., et al. Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomes from T cells to antigen-presenting cells. Nat. Commun. 2, 282 (2011).
- Pegtel, D. M., van de Garde, M. D., Middeldorp, J. M. Viral miRNAs exploiting the endosomal-exosomal pathway for intercellular cross-talk and immune evasion. Biochim. Biophys. Acta. 1809 (11-12), 715-721 (2011).
- Peinado, H., et al. Melanoma exosomes educate bone marrow progenitor cells toward a pro-metastatic phenotype through MET. Nat. Med. 18 (6), 883-891 (2012).
- Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nat. Rev. Immunol. 9 (8), 581-593 (2009).
- Valadi, H., Ekstrom, K., Bossios, A., Sjostrand, M., Lee, J. J., Lotvall, J. O. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nat. Cell Biol. 9 (6), 654-659 (2007).
- Bessho, K., et al. Integrative genomics identifies candidate microRNAs for pathogenesis of experimental biliary atresia. BMC Syst. Biol. 7, (2013).
- Calin, G. A., et al. MicroRNA profiling reveals distinct signatures in B cell chronic lymphocytic leukemias. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (32), 11755-11760 (2004).
- Collins, A. L., et al. A differential microRNA profile distinguishes cholangiocarcinoma from pancreatic adenocarcinoma. Ann. Surg. Oncol. 21 (1), 133-138 (2014).
- He, L., et al. A microRNA polycistron as a potential human oncogene. Nature. 435 (7043), 828-833 (2005).
- Taylor, D. D., Gercel-Taylor, C. MicroRNA signatures of tumor-derived exosomes as diagnostic biomarkers of ovarian cancer. Gynecol. Oncol. 110 (1), 13-21 (2008).
- Rabinowits, G., Gercel-Taylor, C., Day, J. M., Taylor, D. D., Kloecker, G. H. Exosomal microRNA: a diagnostic marker for lung cancer. Clin. Lung Cancer. 10 (1), 42-46 (2009).
- Skog, J., et al. Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers. Nat.Cell Biol. 10 (12), 1470-1476 (2008).
- Lance, R. S., Drake, R. R., Troyer, D. A. Multiple recognition assay reveals prostasomes as promising plasma biomarkers for prostate cancer. Expert Rev. Anticancer Ther. 11 (9), 1341-1343 (2011).
- Li, L., et al. Human bile contains microRNA-laden extracellular vesicles that can be used for cholangiocarcinoma diagnosis. Hepatology. 60 (3), 896-907 (2014).
- Gabriel, D. A., Giordano, K. Microparticle sizing and counting using light scattering methods. Semin. Thromb. Hemost. 36 (8), 824-832 (2010).
- Colombo, M., Raposo, G., Thery, C. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 30, 255-289 (2014).
