Вскрытие и Flat-крепление трёхиглая колюшка жаберных Skeleton

Summary

The branchial skeleton, including gill rakers, pharyngeal teeth, and branchial bones, serves as the primary site of food processing in most fish. Here we describe a protocol to dissect and flat-mount this internal skeleton in threespine sticklebacks. This method is also applicable to a variety of other fish species.

Abstract

The posterior pharyngeal segments of the vertebrate head give rise to the branchial skeleton, the primary site of food processing in fish. The morphology of the fish branchial skeleton is matched to a species’ diet. Threespine stickleback fish (Gasterosteus aculeatus) have emerged as a model system to study the genetic and developmental basis of evolved differences in a variety of traits. Marine populations of sticklebacks have repeatedly colonized countless new freshwater lakes and creeks. Adaptation to the new diet in these freshwater environments likely underlies a series of craniofacial changes that have evolved repeatedly in independently derived freshwater populations. These include three major patterning changes to the branchial skeleton: reductions in the number and length of gill raker bones, increases in pharyngeal tooth number, and increased branchial bone lengths. Here we describe a detailed protocol to dissect and flat-mount the internal branchial skeleton in threespine stickleback fish. Dissection of the entire three-dimensional branchial skeleton and mounting it flat into a largely two-dimensional prep allows for the easy visualization and quantification of branchial skeleton morphology. This dissection method is inexpensive, fast, relatively easy, and applicable to a wide variety of fish species. In sticklebacks, this efficient method allows the quantification of skeletal morphology in genetic crosses to map genomic regions controlling craniofacial patterning.

Introduction

Невероятное количество разнообразия существует в головном скелета у позвоночных, особенно у рыб. Во многих случаях это разнообразие облегчает различные стратегии кормления ^{1 – 4,} и может включать в себя основные изменения внешней и внутренней краниофациальной кучность. Бранхиогенная скелет находится внутри в горле рыбы и окружает большую часть ротовой полости. Бранхиальных скелет состоит из 5 последовательно гомологичных участков, передней четыре из которых поддерживают жабры. Вместе эти пять сегментов функционируют в качестве связующего звена между рыбами и их пищей ^5. Изменение множества признаков, включая жаберных тычинок, глоточных зубов, и жаберных костей способствуют эффективному нагула на различных видах пищи.

Колюшками подверглись адаптивную радиацию после исконных форм океанической колонизировали пресноводные озера и ручьи по всему Северному полушарию. Сдвиг в рационеот мелкого зоопланктона в океане крупную добычу в пресной воде привело к резкому изменению трофической в нескольких краниофациальных ⁶ черт. Хотя многие исследования были сосредоточены на внешних краниофациальных различий в колюшками ^{7 – 13,} важные краниофациальные изменения развиваются неоднократно во внутренней жаберной скелета. Способность создавать плодовитые гибриды между морфологически различных популяций колюшки дает прекрасную возможность сопоставить генетическую основу эволюционировали изменений в жаберного скелета.

Одна трофическая черта экологического значения является структурирование жаберных тычинок, периодических кожных костей, что линия передней и задней грани жаберных костей и используются для фильтрации кормовых объектов. Рыба , которая , как правило , питаются мелкими КБУ , как правило, длиннее и более плотно расположенных жаберных тычинок по сравнению с рыбами , которые питаются большей добычей ^14,15. Различия в жаберных тычинок было сообщено как шithin и между видами ^14-19, а также аспекты жаберной Грабли кучность способствуют трофических ниш и фитнеса ^16. Десятилетия исследований широко документированы число жаберных занижения и изменение длины в трехиглой колюшками ^{17 – 21;} Тем не менее, эти исследования, как правило, сосредоточены на первом ряду жаберных тычинок. Недавние исследования показали , модульность в генетическом контроле числа жаберных Грабли через жаберной скелет ^22,23 и через один ряд в жаберной граблями интервалы между ²³ и длину ²⁴ подчеркивает важность изучения более чем ряд один или один жаберных тычинка , чтобы понять развития генетической основой сокращения жаберных грабли.

Вторая трофическая черта как экологической и биомедицинской значение имеет структурирование глоточных зубов. Зубы у рыб могут быть расположены и в полости рта челюсти и в жаберной скелета, известный как глоточных зубов. Оральные зубов используются в основном для рв то время как захватить Рей глоточные зубы используются для жевания и жертвы манипуляции ^{25 – 27.} Оба множества образуют через общие механизмы развития и считаются онтогенетически гомологичными ^28. Интересная модульность происходит в результате чего некоторые виды, такие как данио, отсутствие полости рта и спинного глоточной зубов ²⁹ в то время как другие виды имеют несколько зубчатыми ceratobranchials, pharyngobranchials, а иногда и зубчатым basihyal и hypobranchials ^30. В колюшки, глоточные зубы встречаются вентрально на пятом ceratobranchial и дорсально на переднем и заднем pharyngobranchials ^31. Кинематика по кормлению колюшки показывают пероральная челюсти используется в основном для захвата добычи и облегчения всасывания кормление ⁹ оставляя жевание в глоточной челюсти. В цихлид, нижняя челюсть морфология глоточной резко меняется ^32,33 , и было показано , чтобы быть адаптивными и коррелировало с трофической ниши ^34. многоPLE популяции пресноводной колюшки развивались резкое увеличение вентральной глоточной числу зубьев ^23,35,36. Недавние исследования показали , что генетическая основа развития этого эволюционировала усиления зуба в значительной степени различны в двух независимо друг от друга популяциях пресноводных колюшки ^36. В отличие от зубов млекопитающих, рыб регенерировать свои зубы непрерывно на протяжении всей взрослой жизни ^37. Оба этих ранее описанных высоких популяций пресноводных зубчатыми развивались ускоренными темпами замены зуба, обеспечивая редкую систему позвоночных для изучения генетической основы регенерации ^36.

Третья трофическая черта , которая развивалась неоднократно в пресноводных колюшки больше epibranchial и ceratobranchial кости, жаберные дуги сегментные гомологи верхней и нижней челюсти, соответственно ^38. Более длинные кости жаберные придают большую щечной полости и, вероятно, являются адаптивными для обеспечения возможности более крупные объекты добычи, чтобы быть сonsumed. Кроме того, в других рыб, epibranchial кости имеют важное значение для депрессии зубных пластин спинной глоточной ^25. Как жаберных тычинок и глоточных зубов, жаберных кости являются внутренними и, таким образом, трудно легко визуализировать или количественно.

Здесь мы представляем подробный протокол рассекать и телевизор с плоским смонтировать жаберный скелет, что позволяет легко визуализировать и количественно оценить разнообразие важных краниофациальных черт. В то время как этот протокол описывает колюшковые рассечение, этот же метод работает на множестве других рыб.

Protocol

Вся рыба работа была одобрена Institutional Animal Care и использования комитета Калифорнийского университета в Беркли (номер протокола R330) путем. Эвтаназии проводили с использованием погружения в 0.025% Tricaine-S забуференный 0,1% -ным раствором бикарбоната натрия 39. Все этапы выполняются при комнатной темпе…

Representative Results

Это приводит протокол в расчлененный и плоской смонтированного жаберной скелета (рисунок 4) , где можно количественно определить целый ряд важных трофических черт. С спинной стороны , все ряды жаберных тычинок, все глоточной зубных пластин, и почти все жабе…

Discussion

The branchial skeleton is a complex set of bones in the throat of a fish that manipulates, filters, and masticates food items on their way to the esophagus. Many interesting trophic traits including the patterning of gill rakers, pharyngeal teeth, and branchial bones vary across and within species. The majority of these traits are difficult to near impossible to accurately measure with the branchial skeleton in situ (e.g., gill raker length, branchial bone length). This flat-mounting protocol places all…

Materials

Sodium Hydroxide (KOH)	EMD	PX1480-1
Glycerol	Sigma-Alderich	G7893-4L
10% Neutral Buffered Formalin (NBF)	Azer Scientific	NBF-4-G
Alizarin Red S	EMD	116-12
Microscope Cover Glasses 22x60mm	VWR	16004-350
100x10mm Glass Petri Dish	Kimble Chase	23064-10010	To dissect samples on
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Ellsworth Adhesives	184 SIL ELAST KIT 0.5KG	Can be poured into glass or plastic petri dishes to make dissecting plates
Modeling Clay	Sargent Art	22-4000	1lb cream
Scintillation Vials (case of 500)	Wheaton	66021-668	Borosilicate Glass with Screw Cap
Forceps-Dumont #5 Inox (Biologie tip)	FST	11252-20	Dumostars are an alternative
Dissecting Scissors	FST	15003-08	Alternate sizes are available depending on size of sample
Dissecting Microscope	Leica	S6E with KL300 LED	Many other models work nicely, having a flat base helps
Microcentrifuge Tubes 1.7mL	Denville	C-2170
Cardboard slide tray	Fisher	12-587-10