L'étude de l'Organisation supramoléculaire de photosynthétiques Membranes dans les tissus foliaires Gel fracturés par Cryo-microscopie électronique à balayage
Summary
Here we describe a procedure for studying freeze-fractured plant tissues. High-pressure frozen leaf samples are freeze-fractured and double-layer coated, yielding well preserved frozen-hydrated samples that are imaged using the cryo-scanning electron microscope at high magnifications with minimal beam damage.
Abstract
microscopie électronique Cryo-balayage (MEB) d'échantillons de gel fracturé permet l'étude des structures biologiques à des conditions proches indigènes. Ici, nous décrivons une technique pour l'étude de l'organisation supramoléculaire de photosynthétiques membranes (thylakoïdes) dans les échantillons de feuilles. Ceci est obtenu par congélation à haute pression des tissus foliaires, congelez-fracturation, revêtement double couche et enfin cryo-SEM imagerie. L'utilisation du procédé de revêtement à double couche permet l'acquisition d'un fort grossissement (> 100,000X) images avec des dommages de faisceau minimal pour les échantillons congelés hydraté ainsi que les effets de charge minimum. En utilisant les procédures décrites , nous avons étudié les modifications dans la distribution supramoléculaire de photosystème et de la lumière-récolte protéines d'antenne complexes qui ont lieu pendant la déshydratation de la plante de la résurrection Craterostigma pumilum, in situ.
Introduction
photosynthèse Oxygenic, originaire de cyanobactérie ancienne, a été hérité par les algues et les plantes terrestres par les événements qui ont conduit à endosymbiotic développement de l'organite chloroplaste. Dans tous les phototrophs oxygénés modernes, le transport photosynthétique d'électrons et la génération de la force proton-motrice et de pouvoir réducteur sont effectuées dans des vésicules de sac-comme aplaties appelées membranes 'thylacoïdes'. Ces membranes abritent les complexes protéiques qui réalisent les réactions légères-driven de la photosynthèse et de fournir un support pour la transduction de l'énergie. Les membranes thylacoïdes de plantes et ( un peu) les algues sont différenciées en deux domaines morphologiques distincts: régions membranaires étroitement apprimés appelées «grana» et les membranes unstacked qui interconnectent le grana, appelés 'stroma lamelles' 1. Diverses études de gel-fracture des plantes et des membranes thylacoïdes d'algues ont été menées, à partir du début des années 1970. Lorsque le gel fracturé, membranesdiviser le long de leur noyau hydrophobe 2, générant une face exoplasmique (EF) et une face protoplasmique (PF), selon le compartiment cellulaire où les frontières demi-membrane, comme initialement inventé par Branton et al. . en 1975 3 Plant and thylakoïdes algues ont quatre faces de rupture différentes: FE, EFU, PF et PFU, avec 's' et dénotant et régions membranaires 'u' 'empilées' 'dépilés', respectivement. Les complexes de protéines membranaires, qui ne sont pas fendus ou cassés, ont tendance à rester avec soit E ou P côté de la membrane. Les premières observations que les différentes faces de rupture des thylakoïdes contiennent des particules de différentes tailles et densités 4, ainsi que les nombreuses enquêtes qui ont suivi, ont conduit à l' identification et la corrélation entre les particules observées et les complexes de protéines membranaires qui effectuent les réactions légères 5-13 (avis voir aussi 14,15).
Freexpériences eze-fracture de membranes thylacoïdes sont généralement réalisées sur des préparations de chloroplastes ou membranes thylakoïdes isolés (mais voir 16,17), au risque de toute modification / organisation structurelle et ou supramoléculaire qui peuvent survenir au cours de la procédure d'isolement. À la suite de la rupture, les répliques sont préparées par évaporation du platine / carbone (Pt / C), puis par une épaisse couche de carbone (C), et enfin la digestion de la matière biologique 18. Des répliques sont visualisés par microscopie électronique à transmission (MET). La technique traditionnelle cryofracturation-réplique continue à servir comme un outil important pour l' étude de l'organisation supramoléculaire des membranes photosynthétiques et leur adaptation à différents, par exemple., Lumière, conditions 19-23.
Dans notre étude récente de la plante de la résurrection homoiochlorophyllous Craterostigma pumilum 24, nous avons cherché à étudier les changements dans l'organisation supramoléculaire omembranes f thylacoïdes, ainsi que dans l'organisation cellulaire globale, au cours de la déshydratation et la réhydratation. Le caractère unique des espèces de résurrection homoiochlorophyllous est qu'ils sont capables de survivre dans des conditions de dessication dans les tissus végétaux (feuilles), tout en conservant leur appareil photosynthétique. Une fois que l' eau est disponible, ces plantes récupérer et reprendre l' activité photosynthétique en quelques heures à quelques jours 25. Pour cette étude, la cryo-ME à balayage (MEB) d'imagerie d'échantillons de feuilles fracturée par congélation a été combiné avec le gel à haute pression pour l'échantillon cryo-immobilisation. Ces procédures fournissent un moyen de visualiser des échantillons biologiques congelés-hydratés à un état proche de leur état natif 26. Un avantage principal est que les échantillons sont examinés directement après cryofracture et le revêtement, sans étapes successives. Ceci est particulièrement pertinent à l'enquête sur les plantes à différentes teneurs en eau relative (RWC), que leur état d'hydratation est maintenue pendant la préparation. Commentde plus, un inconvénient important est que les échantillons congelés hydraté peuvent subir des dommages du faisceau lors de l'imagerie, en particulier lors d'une numérisation à fort grossissement, qui sont nécessaires pour une mesure précise de la taille des complexes photosynthétiques. Pour y remédier, une méthode appelée «revêtement double couche» (DLC) 27,28 combiné à des conditions d'imagerie spécifiques cryo-SEM ont été utilisés. Ceux – ci ont donné lieu à des échantillons qui sont beaucoup moins sensibles à faisceau et ont permis l'élucidation de précieuses informations sur la protéine photosynthétique organisation supramoléculaire et d' autres constituants cellulaires de la plante de la résurrection C. pumilum à fort grossissement in situ.
Protocol
Representative Results
Discussion
La technique décrite dans ce document permet l'étude des membranes de gel fracturé dans le contexte des tissus végétaux congelés à haute pression bien conservés par microscopie électronique à balayage cryo. Le principal avantage de l'utilisation de ces procédures est que la préparation de l'échantillon est purement physique; aucune mesure impliquant des produits chimiques ou la déshydratation sont nécessaires. Ainsi, il permet d' étudier les structures biologiques à un état quasi-…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Andres Kaech (Université de Zurich) pour ses conseils utiles sur la numérisation imagerie par microscopie électronique. Ce travail a été soutenu par le Fonds des États-Unis-Israël binationale de recherche agricole et le développement (subvention no. US-4334-10, ZR), la Science Foundation Israël (subvention no. 1034/12, ZR) et le Human Frontier Science Program (RGP0005 / 2013, ZR). Les études de microscopie électronique ont été réalisées à l'Irving et le Centre Moskowitz Cherna pour Nano et Bio-Nano Imaging à l'Institut Weizmann des Sciences.
Materials
| ethanol abs | Bio-Lab | 052505 | |
| isopropanol | Bio-Lab | 162605 | |
| 1-hexadecene | Sigma-Aldrich | H7009 | |
| 0.1/0.2 platelets | Engineering Office M. Wohlwend GmbH, Switzerland | 241 | Platelets are of 3-mm diameter and 0.5-mm-thick (Type A) with 0.1/0.2-mm-deep cavities (of diamater 2 mm). Similar platelets can be obtained from Leica Microsystems. |
| high-precision-grade tweezers | Electron Microscopy Sciences | 72706-01 | Dumont (Switzerland) Durostar style #5 tweezers; Can be substituted with other high-precision tweezers. |
| high-pressure freezing machine | Bal-Tec | HPM 010 | High-pressure freezing alternatives: 1. HPF Compact 02, Wohlwend GmbH; 2. HPM 010, RMC Boeckeler; 3. EM PACT2, Leica Microsystems; 4. EM HPM 100, Leica Microsystems; 5. EM ICE, Leica Microsystems. |
| freeze-fracture system | Leica Microsystems | EM BAF 060 | |
| cryo preparation loading stage | Leica Microsystems | 16770228 | |
| specimen holder for univeral freeze fracturing | Leica Microsystems | 16LZ04746VN | Clamp holder for specimen carriers of diameter 3 mm |
| vacuum cryo-transfer shuttle | Leica Microsystems | EM VCT 100 | |
| scanning electron microscope | Zeiss | Ultra 055 | |
| cryo SEM stage | Leica Microsystems | 16770299905 | |
| image acquisiton software | SmartSEM, Carl Zeiss Microscopy GmbH | ||
| image analysis software | Fiji/Image J, National Institute of Health | http://fiji.sc/Fiji |
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