L'étude de l'Organisation supramoléculaire de photosynthétiques Membranes dans les tissus foliaires Gel fracturés par Cryo-microscopie électronique à balayage

Résumé

Nous décrivons ici une procédure d’étude des tissus végétaux fracturés par congélation. Les échantillons de feuilles congelées à haute pression sont fracturés par congélation et recouverts d’une double couche, ce qui permet d’obtenir des échantillons congelés-hydratés bien conservés qui sont imagés à l’aide du microscope électronique à balayage cryogénique à des grossissements élevés avec des dommages minimaux au faisceau.

Résumé

microscopie électronique Cryo-balayage (MEB) d'échantillons de gel fracturé permet l'étude des structures biologiques à des conditions proches indigènes. Ici, nous décrivons une technique pour l'étude de l'organisation supramoléculaire de photosynthétiques membranes (thylakoïdes) dans les échantillons de feuilles. Ceci est obtenu par congélation à haute pression des tissus foliaires, congelez-fracturation, revêtement double couche et enfin cryo-SEM imagerie. L'utilisation du procédé de revêtement à double couche permet l'acquisition d'un fort grossissement (> 100,000X) images avec des dommages de faisceau minimal pour les échantillons congelés hydraté ainsi que les effets de charge minimum. En utilisant les procédures décrites , nous avons étudié les modifications dans la distribution supramoléculaire de photosystème et de la lumière-récolte protéines d'antenne complexes qui ont lieu pendant la déshydratation de la plante de la résurrection Craterostigma pumilum, in situ.

Introduction

photosynthèse Oxygenic, originaire de cyanobactérie ancienne, a été hérité par les algues et les plantes terrestres par les événements qui ont conduit à endosymbiotic développement de l'organite chloroplaste. Dans tous les phototrophs oxygénés modernes, le transport photosynthétique d'électrons et la génération de la force proton-motrice et de pouvoir réducteur sont effectuées dans des vésicules de sac-comme aplaties appelées membranes 'thylacoïdes'. Ces membranes abritent les complexes protéiques qui réalisent les réactions légères-driven de la photosynthèse et de fournir un support pour la transduction de l'énergie. Les membranes thylacoïdes de ....

Protocole

1. Cryo-fixation de feuilles Tissues par haute pression de congélation

Remarque: Cette section décrit comment effectuer la congélation à haute pression des tissus foliaires pour une expérience de fracture par congélation. Pour des raisons liées à des échantillons de plantes voir ^29. Ceci peut être adapté à d'autres types de tissus ou des échantillons avec quelques modifications.

1. En utilisant l'angle d'une lame de rasoir, gratter le fond de la cavité de 0,1 mm d'une plaquette d'aluminium de 0,1 / 0,2 mm (figure 1). Préparer au moins une douzaine de plaquettes (6 échantillons). Pren....

Résultats

La figure 1 montre des images cryo-MEB de plaquettes contenant congelé, fracturés Craterostigma pièces pumilum foliaires haute pression. Dans certains échantillons, de grandes régions de cellules brisées sont obtenues (figure 1A). Dans d' autres cas , la pièce de la feuille reste fortement liée au disque supérieur et est arraché avec elle (figure 1B). Cependant, même dans le second cas, une partie du tissu de la feu.......

Discussion

La technique décrite dans ce document permet l'étude des membranes de gel fracturé dans le contexte des tissus végétaux congelés à haute pression bien conservés par microscopie électronique à balayage cryo. Le principal avantage de l'utilisation de ces procédures est que la préparation de l'échantillon est purement physique; aucune mesure impliquant des produits chimiques ou la déshydratation sont nécessaires. Ainsi, il permet d' étudier les structures biologiques à un état ​​quasi-native ^26,32.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Éthanol abs	Bio-Lab	052505
Isopropanol	Bio-Lab	162605
1-hexadécène	Sigma-Aldrich	H7009
0,1/0,2 Plaquettes	Bureau d’études M. Wohlwend GmbH, Suisse	241	Les plaquettes ont un diamètre de 3 mm et une épaisseur de 0,5 mm (type A) avec des cavités de 0,1/0,2 mm de profondeur (diamètre 2 mm). Des plaquettes similaires peuvent être obtenues auprès de Leica Microsystems.
Pince à épiler de haute précision	Microscopie électronique Sciences	72706-01	Dumont (Suisse) Pince à épiler de style Durostar #5 ; Peut être remplacé par d’autres pinces à épiler de haute précision.
Machine de congélation haute pression	Bal-Tec	HPM 010	Alternatives de congélation à haute pression : 1. HPF Compact 02, Wohlwend GmbH ; 2. HPM 010, CMR Boeckeler ; 3. EM PACT2, Leica Microsystems ; 4. EM HPM 100, Leica Microsystems ; 5. EM ICE, Leica Microsystems.
Système de congélation-fracture	Leica Microsystems	EM BAF 060
Préparation cryogénique Étape de chargement	Leica Microsystems	16770228
Porte-échantillon pour fracturation universelle par congélation	Leica Microsystems	16LZ04746VN	Porte-pince pour porte-échantillons de diamètre 3 mm
Navette de cryotransfert sous vide	Leica Microsystems	EM VCT 100
Microscope électronique à balayage	Zeiss	Ultra 055
Cryo Platine MEB	Leica Microsystems	16770299905
Logiciel d’acquisition d’images	SmartSEM, Carl Zeiss Microscopy GmbH
Logiciel d’analyse	d’images Fidji/Image J, Institut national de la santé http://fiji.sc/Fiji