إزالة المواد من مصادر خارجية من الجزء الخارجي من النوى المجمدة للتحقيق في المجتمعات القديمة البيولوجية آوى داخل
Summary
يوفر الغلاف الجليدي الوصول إلى الكائنات الحفاظ عليها التي لا تزال قائمة في ظل ظروف بيئية الماضية. ويرد بروتوكول لجمع وتطهير النوى الجليد السرمدي من التربة والجليد. غياب المستعمرات الخارجية والحمض النووي تشير إلى أن الكائنات الحية الدقيقة الكشف تمثل المواد، بدلا من التلوث الناجم عن الحفر أو المعالجة.
Abstract
The cryosphere offers access to preserved organisms that persisted under past environmental conditions. In fact, these frozen materials could reflect conditions over vast time periods and investigation of biological materials harbored inside could provide insight of ancient environments. To appropriately analyze these ecosystems and extract meaningful biological information from frozen soils and ice, proper collection and processing of the frozen samples is necessary. This is especially critical for microbial and DNA analyses since the communities present may be so uniquely different from modern ones. Here, a protocol is presented to successfully collect and decontaminate frozen cores. Both the absence of the colonies used to dope the outer surface and exogenous DNA suggest that we successfully decontaminated the frozen cores and that the microorganisms detected were from the material, rather than contamination from drilling or processing the cores.
Introduction
الغلاف الجليدي (على سبيل المثال، والتربة دائمة التجمد، ملامح الجليد والثلوج الجليدية، فيرن، والجليد) تعطي لمحة عن أنواع الكائنات الحية استمرت في ظل ظروف بيئية الماضية. وبما أن هذه ركائز يمكن أن يكون عشرات ومئات الآلاف من السنين القديمة ومجتمعاتهم الميكروبية، عندما حفظت مجمدة منذ الترسيب، وتعكس الظروف البيئية القديمة. لتحليل هذه النظم الإيكولوجية بشكل مناسب واستخراج المعلومات البيولوجية ذات مغزى من التربة المجمدة والجليد، وجمع الصحيح وتجهيز العينات المجمدة من الضروري. هذا هو من أهمية قصوى كما الإسقاطات المناخية للقرن الحادي و21 تشير إلى احتمال ارتفاع درجة الحرارة وضوحا في المناطق القطبية الشمالية ومناطق القطب الشمالي الفرعية 1. على وجه التحديد، من المتوقع لتدفئة حوالي 5 درجات مئوية و 7 درجات مئوية، على التوالي بحلول عام 2100 2،3 ألاسكا الداخلية وغرينلاند. ومن المتوقع أن تؤثر بشكل كبير على التربة والمجتمعات الميكروبية المائية، وبالتالي، يرتبط هذاالعمليات البيولوجية الكيميائية. ومن المتوقع أن يبدأ تدهور الأراضي دائمة التجمد في العديد من المجالات 2-5 مما قد يؤدي إلى سمكا، إذابة موسميا (نشط) طبقة 6،7، وذوبان التربة المجمدة، وذوبان الجليد الهيئات الضخمة مثل ارتفاع درجات الحرارة وهطول الأمطار النظام تغير الجليد الأرضي، أسافين الجليد، وفصل الجليد 8. هذا من شأنه أن يحدث تغييرا هائلا في الصفات البيولوجية الكيميائية بالإضافة إلى التنوع البيولوجي للنباتات والحيوانات في هذه النظم الإيكولوجية.
الجليد الجليد وsyngenetic الرواسب دائمة التجمد والجليد ميزات قد حوصر الأدلة البيولوجية للبيئة تمثل ما عاش هناك في ذلك الوقت ملامح شكلت الكيميائية و. على سبيل المثال، في ولاية ألاسكا الداخلية، سواء Illinoisan ويسكونسن الذين تتراوح أعمارهم بين الجليد الدائم والحاضر وهذا الجليد الدائم على وجه الخصوص يوفر مواقع فريدة من نوعها تعود من الحديث إلى 150،000 سنة قبل الوقت الحاضر (YBP) التي تحتوي على الأدلة البيولوجية والجيوكيميائية من السلطة الإسرائيليةط م من التغيرات المناخية الماضية على التنوع البيولوجي. ونتيجة لذلك، توفر هذه الرواسب سجل من البيوجيوكيميائية والتنوع البيولوجي على امتداد آلاف السنين. منذ المنطقة لديها معدلات ترسيب منخفض، ولم يكن الجليدية، والعينات دون عائق يمكن الوصول إليها لجمع وتحليل، إما الحفر رأسيا في التربة أو الحفر أفقيا في الأنفاق. الأهم من ذلك، سجلات واسعة موجودة التي تبرز خصوصا الميزات البيولوجية الكيميائية الفريدة من الجليد في هذه المنطقة 9-14. على وجه التحديد، وتطبيق تحليل الحمض النووي لتقدير وجود ومدى التنوع البيولوجي في كل من عينات الجليد والتربة المتجمدة موجودة وقديمة يتيح استكشاف الربط بين الظروف البيئية القديمة والسكن للاحتلال من قبل كائنات محددة.
وقد حددت الدراسات السابقة التأثيرات المناخية على الثدييات والنباتات والكائنات الحية الدقيقة من عينات تعود إلى 50K YBP 11، 15-19، على الرغم من كل دراسة استخدمت احمنهجية الإقليم الشمالي لجمع وتطهير التربة المتجمدة أو الجليد النوى. في بعض الحالات، تم تعقيمها النوى حفر 16، 20-21، على الرغم من أن منهجية محددة لم توضح ما إذا كانت الأحماض النووية الأجنبية ألغيت أيضا من العينات. في دراسات أخرى، بكتيريا يعزل 15 (على سبيل المثال، السراتية الذابلة) وكذلك المجهرية الفلورسنت 22 استخدمت لقياس مدى فعالية إجراءات إزالة التلوث.
وكانت هذه التجربة جزءا من دراسة أكبر التحقيق المجتمعات الميكروبية من عينات التربة المتجمدة التي يعود تاريخها إلى ما يقرب من 40K YBP. وكان الهدف المحدد لهذا الجزء من الدراسة لتطهير الثلج والجليد السرمدي النوى بنجاح. على حد علمنا، لا يوجد لديه منهجية متكاملة لاستخدام حلول تهدف إلى القضاء على الأحماض النووية الأجنبية وnucleases المرتبطة من الجزء الخارجي من النوى المجمدة. هذا على الرغم من حقيقة أن هذه الحلول هي commonlذ استخدامها لتطهير معدات المختبرات لإجراء التجارب الجزيئية.
مرة واحدة تم تطهير النوى، تم استخراج الحمض النووي الجيني باستخدام البروتوكولات التي وضعتها غريفيث وآخرون. 23 وتووي وآخرون. 24، كميا باستخدام مقياس الطيف الضوئي، وتضعف مع الماء المعقم، وخالية من الحمض النووي لتحقيق 20 نانوغرام في رد الفعل. وتضخمت البكتيرية الجينات 16S الريباسي مع الاشعال 331F و797R وسبر BacTaq 25 و 16S archaeal وتضخمت الريباسي الجينات مع الاشعال قوس 349F وقوس 806R وتحقيق TM قوس 516F 26 وفقا للشروط التالية: 95 درجة مئوية لمدة 600 ثانية تليها 45 دورات من 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 57 درجة مئوية لمدة 60 ثانية، و 72 درجة مئوية لمدة 25 ثانية مع التمديد النهائي عند 40 درجة مئوية لمدة 30 ثانية. وأجريت جميع ردود الفعل QPCR في نسختين. شملت 20 مجلدا رد فعل ميكرولتر 20 نانوغرام الحمض النووي، و 10 ميكرومتر الاشعال، 5 ميكرومتر لجنة التحقيق، و 10 ميكرولتر من مزيج رد فعل QPCR. معايير FOص البكتيرية وarchaeal QPCR تم إعدادها باستخدام الحمض النووي الجيني من الزائفة المتألقة وملحاء عصوية ملحية، على التوالي. كانت تزرع على حد سواء لتسجيل المرحلة. أجريت التهم لوحة وتم عزل الحمض النووي من الثقافات. وكان كميا الجينوم الحمض النووي مع معمل مع افتراض واحد وستة نسخ من الجين 16S الريباسي في الجينوم له. salinarum و P. المتألقة، على التوالي 27-28. حسبت أعداد نسخة من الجينات البكتيرية وarchaeal على أساس منحنى قياسي، سجل حولت لحساب الفروق غير المتكافئة بين العلاجات، والمقررة من قبل ANOVA.
تم تحديد تكوين المجتمع من خلال تسلسل الجينات 16S الريباسي باستخدام خلايا تدفق والتكنولوجيات تضخيم الجسر وتحليل المجتمعات مع "رؤى الكمي في البيئة الميكروبية" (QIIME) 29. إلى الأمام وعكس يقرأ وانضم معا ثم تسلسل تم تصفيتها، فهرسة،وتم اختيار ممثلي ذات جودة عالية لدي نوفو الوحدات التصنيفية التشغيلية (اتو) التعيين من خلال تسلسل المحاذاة مع قاعدة بيانات مرجعية. وتمت مقارنة تسلسل الانحياز إلى قاعدة بيانات مرجعية مستقلة للتعيين التصنيفية. تم إنشاء جدول OTU مستوى الأسرة في اللغات لتحديد تكوين المجتمع العام.
Protocol
Representative Results
Discussion
يوفر الغلاف الجليدي الوصول إلى الكائنات الحفاظ عليها التي لا تزال قائمة في ظل ظروف بيئية الماضية. على الرغم من أن الأصناف تعافى قد لا تمثل المجتمع التاريخي الكامل، وتلك المستخرجة من تحليل عينات الجليد والتربة المتجمدة الجليدية يمكن أن تسفر عن معلومات تاريخية قيمة ع?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded through the U.S. Army Engineer Research and Development Center, Basic Research Program Office. Permission for publishing this information has been granted by the Chief of Engineers.
Materials
| Auger | Snow, Ice, and Permafrost Research Establishment (SIPRE), Fairbanks, AK | N/A | |
| 70% Isopropanol | Walmart | 551116880 | |
| 95% Ethyl Alcohol (denatured) | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | A407-4 | |
| DNA decontamination solution, DNA Away | Molecular Bio-Products, Inc., San Diego, CA | 7010 | |
| RNase decontamination solution, RNase Away | Molecular Bio-Products, Inc., San Diego, CA | 7002 | |
| Light Duty Suits | Kimberly-Clark Professional, Roswell, GA | 10606 | |
| Nitrile Gloves | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | FFS-700 | |
| Antiviral Masks | Curad, Walgreens | CUR3845 | |
| Sterile Sample Bags | Nasco, Fort Atkinson, WI | B01445 | |
| Steel Microtome Blade | B-Sharp Microknife, Wake Forest, NC | N/A | |
| Metal Rack | Fabricated at CRREL, Hanover, NH | N/A | |
| Tray | Handy Paint Products, Chanhassen, MN | 7500-CC | |
| Aluminum Foil | Western Plastics, Temecula, CA | N/A | |
| 500 ml Bottle with 0.22 μm Filter | Corning, Corning, NY | 430513 | |
| Serratia marcescens | ATCC, Manassas, VA | 17991 | |
| Biosafety Hood | NuAire, Plymouth, MN | NU-425-400 | |
| Petri Dish | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | FB0875712 | |
| ATCC Agar 181- Tryptone | Acros Organics, NJ | 61184-5000 | |
| ATCC Agar 181- Glucose | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP381-500 | |
| ATCC Agar 181- Yeast Extract | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP1422-500 | |
| ATCC Agar 181- Dipotassium Phosphate | JT Baker, Phillipsburg, NJ | 3252-01 | |
| ATCC Agar 181- Agar | Difco, Sparks, MD | 214530 | |
| NanoDrop 2000 UV Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE | ||
| Lightcycler 480 System | Roche Molecular Systems, Inc., Indianapolis, IN | ||
| Halobacterium salinarum | American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA | ||
| Pseudomonas fluorescens | American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA | ||
| Microbial DNA Isolation Kit | MoBio Laboratories, Carlsbad, CA | 12224-50 | |
| Ear Protection | Elvex | EP-201 | |
| Hard Hat | N/A | N/A | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Professional, Roswell, GA | 34705 | |
| Glass Wool | Pyrex | 430330 | |
| Ruler | N/A | N/A | |
| Weighing Tin | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 08-732-100 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich, St Louis, MO | S-9625 | |
| Potassium chloride | JT Baker, Phillipsburg, NJ | 3040-04 | |
| Potassium phosphate, monobasic | JT Baker, Phillipsburg, NJ | 3246-01 | |
| Potassium phosphate, dibasic | JT Baker, Phillipsburg, NJ | 3252-01 | |
| Sodium phosphate dibasic, anhydrous | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP332-500 | |
| 50 ml Centrifuge Tubes | Corning, Corning, NY | 4558 | |
| 2 ml Microcentrifuge Tubes | MoBio Laboratories, Carlsbad, CA | 1200-250-T | |
| 2 ml Ceramic Bead Tubes (1.4 mm) | MoBio Laboratories, Carlsbad, CA | 13113-50 | |
| Scoopula | Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE | 1437520 | |
| Balance | Ohaus, Parsippany, NJ | E12130 | |
| Diethylpyrocarbonate (DEPC) | Sigma Aldrich, St Louis, MO | D5758 | |
| Hexadecyltrimethylammoniabromide (CTAB) | Acros Organics, NJ | 22716-5000 | |
| Polyethylene glycol 8000 | Sigma Aldrich, St Louis, MO | P5413-1KG | |
| Phenol-chloroform-isoamyl alcohol (25:24:1) (pH 8) | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP1752-400 | |
| Centrifuge | Eppendorf, Hauppauge, NY | 5417R | |
| Chloroform-isoamyl alcohol (24:1) | Sigma Aldrich, St Louis, MO | C0549-1PT | |
| TE Buffer | Ambion (Thermo Fisher), Wilmington, DE | AM9860 | |
| Pipets | Rainin, Woburn, MA | Pipet Lite XLS, 2, 10, 200, 1nd 1000ul pipets | |
| Pipet tips | Rainin, Woburn, MA | Rainin LTS presterilized, low retention, filtered tips, 10, 20, 200, 1000ul | |
| Vortexor | Scientific Industries, Bohemia, NY | G-560 | |
| Vortex Adaptor | MoBio Laboratories, Carlsbad, CA | 13000-V1 | |
| Clear Bottle | Corning, Corning, NY | C1395500 | |
| Amber Bottle | Corning, Corning, NY | C5135250 | |
| Bottle Top Filters, 0.22um | Corning, Corning, NY | 430513 | |
| 60 mL Syringe | Becton, Dickenson and Company, Franklin Lakes, NJ | BD 309653 | |
| Millex Syringe filters, 0.22 μm | EMD Millipore, Billerica, MA | SLGV033RB | |
| 70% Ethanol | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP2818-500 | diluted & filter sterilized |
| Isotemp 100 L Oven | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 151030511 | |
| Cell Spreader | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 08-100-10 | |
| Disposable Inoculating Loops | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 22-363-602 |
References
- Solomon, S., et al. . Climate Change 2007: The Physical Science Basis. , (2007).
- Marchenko, S., Romanovsky, V., Tipenko, G. Numerical Modeling of Spatial Permafrost Dynamics in Alaska. Proc. Ninth Int. Conferen. Permafr. 29, 1125-1130 (2008).
- Pachauri, R. K., Meyer, L. A. . Climate Change 2014: Synthesis Report. Contributions of Working Groups I, II, and III to the Fifth Assessment Report of the Intergovernmental Panel on Climate Change. , (2007).
- Osterkamp, T. E., Romanovsky, V. E. Evidence for warming and thawing of discontinuous permafrost in Alaska. Permafr. Periglac. Process. 10 (1), 17-37 (1999).
- Wolken, J. M., et al. Evidence and implications of recent and projected climate change in Alaska’s forest ecosystems. Ecosphere. 2 (11), 1-35 (2011).
- Hinzman, L. D., Kane, D. L., Gieck, R. E., Everett, K. R. Hydrologic and thermal properties of the active layer in the Alaskan Arctic. Cold Reg. Sci. Technol. 19 (2), 95-110 (1991).
- Hinzman, L. D., Goering, D. J., Kane, D. L. A distributed thermal model for calculating temperature profiles and depth of thaw in permafrost regions. J. Geophys. Res.: Atmos. 103 (D22), 28975-28991 (1998).
- Osterkamp, T. E., Jorgenson, J. C. Warming of Permafrost in the Arctic National Wildlife Refuge. Alaska. Permafr. Periglac. Process. 17, 65-69 (2006).
- Petrone, K. C., Jones, J. B., Hinzman, L. D., Boone, R. D. Seasonal export of carbon, nitrogen, and major solutes from Alaskan catchments with discontinuous permafrost. J. Geophys. Res. 111, G02020 (2006).
- Guo, L., Ping, C. -. L., Macdonald, R. W. Mobilization pathways of organic carbon from permafrost to arctic rivers in a changing climate. Geophys. Res. Lett. 34 (13), L13603 (2007).
- Katayama, T., et al. Phylogenetic analysis of bacteria preserved in a permafrost ice wedge for 25,000 years. Appl. Environ. Microbiol. 73 (7), 2360-2363 (2007).
- Katayama, T., et al. Glaciibacter superstes gen. nov., sp. nov., a novel member of the family Microbacteriaceae isolated from a permafrost ice wedge. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 59, 482-486 (2009).
- Waldrop, M. P., White, R., Douglas, T. A. Isolation and identification of cold-adapted fungi in the Fox Permafrost Tunnel, Alaska. Proc. Ninth Int. Conferen. Permafr. , 1887-1891 (2008).
- Douglas, T. A., et al. Biogeochemical and geocryological characteristics of wedge and thermokarst-cave ice in the CRREL Permafrost Tunnel. Alaska Permafr. Periglac. Process. 21 (2), 120-128 (2011).
- Willerslev, E., et al. Diverse plant and animal genetic records from Holocene and Pleistocene sediments. Science. 300 (5620), 791-795 (2003).
- Bellemain, E., et al. Fungal palaeodiversity revealed using high-throughput metabarcoding of ancient DNA from Arctic permafrost. Environ. Microbiol. 15 (4), 1176-1189 (2013).
- Steven, B., Pollard, W. H., Greer, C. W., Whyte, L. G. Microbial diversity and activity through a permafrost/ground ice core profile from the Canadian high Arctic. Environ. Microbiol. 10 (12), 3388-3403 (2008).
- Lorenzen, E. D., et al. Species-specific responses of Late Quaternary megafauna to climate and humans. Nature. 479 (7373), 359-364 (2011).
- Wilhelm, R. C., Radtke, K., Mykytczuk, N. C. S., Greer, C. W., Whyte, L. G. Life at the wedge: The activity and diversity of Arctic ice wedge microbial communities. Astrobiol. 12 (4), 347-360 (2012).
- Sheriden, P. P., Miteva, V. I., Brenchley, J. E. Phylogenetic analysis of anaerobic psychrophilic enrichment cultures obtained from a Greenland glacier ice core. Appl. Environ. Microbiol. 69 (4), 2153-2160 (2003).
- Rivkina, E., et al. Biogeochemistry of methane and methanogenic archaea in permafrost. FEMS Microbiol. Ecol. 61 (1), 1-15 (2007).
- Juck, D. F., et al. Utilization of fluorescent microspheres and a green fluorescent protein-marked strain for assessment of microbiological contamination of permafrost and ground ice core samples from the Canadian High Arctic. Appl. Environ. Microbiol. 71 (2), 1035-1041 (2005).
- Griffiths, R. I., Whiteley, A. S., O’Donnell, A. G., Bailey, M. J. Rapid method for coextraction of DNA and RNA from natural environments for analysis of ribosomal DNA- and rRNA-based microbial community composition. Appl. Environ. Microbiol. 66 (12), 5488-5491 (2000).
- Töwe, S., et al. Improved protocol for the simultaneous extraction and column-based separation of DNA and RNA from different soils. J. Microbiol. Methods. 84 (3), 406-412 (2011).
- Nadkarni, M. A., Martin, F. E., Jacques, N. A., Hunter, N. Determination of bacterial load by real-time PCR using a broad range (universal) probe and primers set. Microbiol. 148, 257-266 (2002).
- Takai, K., Horikoshi, K. Rapid detection and quantification of members of the archaeal community by quantitative PCR using fluorogenic probes. Appl. Environ. Microbiol. 66 (11), 5066-5072 (2000).
- Fogel, G. B., Collins, C. R., Brunk, C. F. Prokaryotic genome size and SSU rDNA copy number: Estimation of microbial relative abundance from a mixed population. Microb. Ecol. 38, 93-113 (1999).
- Bodilis, J., Nsigue-Meilo, S., Besaury, L., Quillet, L. Variable copy number, intra-genomic heterogeneities and later transfers of the 16S rRNA gene in Pseudomonas. PLOS One. 7, e35647 (2012).
- Caporaso, J. G., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature Methods. 7, 335-336 (2010).
- Sellmann, P. V. . Geology of the USA CRREL permafrost tunnel, Fairbanks, Alaska. US Army Cold Reg. Res. Eng. Lab. Technical Rep. 199. , (1967).
- Sellmann, P. V. . Additional information on the geology and properties of materials exposed in the USA CRREL permafrost tunnel. US Army CRREL Special Rep. , (1972).
- Christner, B. C., Mikucki, J. A., Foreman, C. M., Denson, J., Priscu, J. C. Glacial ice cores: A model system for developing extraterrestrial decontamination protocols. Icarus. 174 (2), 572-584 (2005).
- Mackelprang, R., et al. Metagenomic analysis of a permafrost microbial community reveals a rapid response to thaw. Nature. 480 (7377), 368-371 (2011).
- Champlot, S., et al. An efficient multistrategy DNA decontamination of PCR reagents for hyper sensitive PCR applications. PLoS One. 5 (9), e13042 (2010).
- Yergeau, E., Hogues, H., Whyte, L. G., Greer, C. W. The functional potential of high Arctic permafrost revealed by metagenomic sequencing, qPCR, and microarray analyses. The ISME J. 4 (9), 1206-1214 (2010).
- Welzl, G., Schloter, M. Bacterial community structure in soils of the Tibetan Plateau affected by discontinuous permafrost or seasonal freezing. Biol. Fertil. Soils. 50 (3), 555-559 (2014).
- Vishnivetskaya, T. A., et al. Commercial DNA extraction kits impact observed microbial community composition in permafrost samples. FEMS Microbiol. Ecol. 87 (1), 217-230 (2014).
- Wagner, D., Kobabe, S., Liebner, S. Bacterial community structure and carbon turnover in permafrost-affected soils of the Lena Delta, northeastern Siberia. Can. J. Microbiol. 55 (1), 73-83 (2009).
- Jiang, N., et al. Characteristic microbial communities in the continuous permafrost beside the bitumen in Qinghai-Tibetan Plateau. Environ. Earth Sci. 74, 1343-1352 (2015).
