Enlèvement des matériaux exogènes de la partie extérieure des surgelés Cores d'enquêter sur l'Ancien Communautés biologiques nourrissais intérieur
Summary
La cryosphère offre un accès à des organismes préservés qui ont persisté dans des conditions environnementales passées. Un protocole est présenté à recueillir et à décontaminer les carottes de pergélisol des sols et de la glace. L'absence de colonies exogènes et de l'ADN suggèrent que les micro-organismes détectés représentent la matière, plutôt que la contamination par le forage ou le traitement.
Abstract
The cryosphere offers access to preserved organisms that persisted under past environmental conditions. In fact, these frozen materials could reflect conditions over vast time periods and investigation of biological materials harbored inside could provide insight of ancient environments. To appropriately analyze these ecosystems and extract meaningful biological information from frozen soils and ice, proper collection and processing of the frozen samples is necessary. This is especially critical for microbial and DNA analyses since the communities present may be so uniquely different from modern ones. Here, a protocol is presented to successfully collect and decontaminate frozen cores. Both the absence of the colonies used to dope the outer surface and exogenous DNA suggest that we successfully decontaminated the frozen cores and that the microorganisms detected were from the material, rather than contamination from drilling or processing the cores.
Introduction
La cryosphère (par exemple, les sols du pergélisol, les caractéristiques de la glace, la neige glaciaire, névé et glace) offre un aperçu de ce que les types d'organismes persisté dans des conditions environnementales passées. Étant donné que ces substrats peuvent être des dizaines à des centaines de milliers d'années, leurs communautés microbiennes, lorsque conservés, congelés depuis le dépôt, tenir compte des conditions environnementales anciennes. Pour analyser correctement ces écosystèmes et d'extraire l'information biologique significative des sols gelés et de la glace, une bonne collecte et le traitement des échantillons congelés est nécessaire. Ceci est d'une importance capitale que les projections climatiques pour le 21 ème siècle , indiquent la possibilité d'un réchauffement prononcé dans les régions arctiques et subarctiques 1. Plus précisément, l' intérieur de l' Alaska et le Groenland devraient se réchauffer à environ 5 ° C et 7 ° C, respectivement en 2100 2,3. Cela devrait avoir un impact significatif sol et les communautés microbiennes aquatiques et, par conséquent, liéles processus biogéochimiques. On prévoit que les températures plus chaudes et régime des précipitations modifié pour initier la dégradation du pergélisol dans de nombreux domaines 2-5 conduisant potentiellement à un plus épais, décongelé saisonnièrement (actif) couche 6,7, la fonte des sols gelés, et la fonte des masses de glace massifs tels que glace au sol, des coins de glace, et la ségrégation de la glace 8. Cela changerait radicalement les attributs biogéochimiques en plus de la biodiversité des plantes et des animaux dans ces écosystèmes.
glaciaires et du pergélisol sédiments et de glace caractéristiques syngénétiques ont piégé chimique et des preuves biologiques d'un environnement qui représente ce qui y vivait au moment où les caractéristiques formées. Par exemple, dans l'intérieur de l'Alaska, à la fois Illinoisan et le Wisconsin permafrost âgés sont présents et ce pergélisol, en particulier fournit des endroits uniques datant de moderne à 150.000 ans avant le présent (YBP) qui contiennent des preuves biologiques et géochimiques de l'impact des changements climatiques passés sur la biodiversité. Par conséquent, ces sédiments fournissent un enregistrement de la biogéochimie et de la biodiversité sur plusieurs milliers d'années. Étant donné que la région a faibles taux de sédimentation et n'a jamais été englacée, des échantillons intacts sont accessibles pour la collecte et l'analyse, soit le forage verticalement dans le profil du sol ou de forage horizontal dans les tunnels. Plus important encore , nombreux documents existent qui en particulier mettre en évidence les caractéristiques biogéochimiques uniques du pergélisol dans cette région 9-14. Plus précisément, l'application de l'analyse d'ADN pour estimer la présence et l'étendue de la biodiversité dans les deux échantillons de glace et pergélisol existants et anciens permet l'exploration du lien entre les conditions environnementales anciennes et de l'habitat à l'occupation par des organismes spécifiques.
Des études précédentes ont identifié des impacts climatiques sur les mammifères, les plantes et les micro – organismes à partir d' échantillons datant de 50k YBP 11, 15-19, bien que chaque étude a utilisé un differeméthodologie nt à recueillir et à décontaminer les pergélisol ou les carottes de glace. Dans certains cas, les carottes de forage ont été stérilisées 16, 20-21, bien que la méthodologie spécifique n'a pas précisé si les acides nucléiques étrangers ont également été éliminés des échantillons. Dans d' autres études, 15 isolats bactériens (par exemple, Serratia marcescens), ainsi que des microsphères fluorescentes 22 ont été utilisées pour mesurer l'efficacité des procédures de décontamination.
Cette expérience faisait partie d'une étude plus vaste enquête sur les communautés microbiennes à partir d'échantillons de pergélisol remontant à environ 40k YBP. L'objectif spécifique de cette partie de l'étude était de décontaminer avec succès la glace et pergélisol noyaux. À notre connaissance, aucune méthodologie a intégré l'utilisation de solutions conçues pour éliminer les acides nucléiques étrangers et nucléases associés de la partie extérieure des noyaux congelés. Ceci en dépit du fait que ces solutions sont commonly utilisée pour décontaminer l'équipement de laboratoire pour des expériences moléculaires.
Une fois que les noyaux ont été décontaminés, l' ADN génomique a été extrait en utilisant les protocoles mis au point par Griffiths et al. , Et 23 Töwe et al. , 24, quantifié en utilisant un spectrophotomètre, et dilué avec de l' eau stérile, exempte d' ADN pour obtenir 20 ng par réaction. Bactériennes gènes 16S ARNr ont été amplifiés avec des amorces 331F et 797R et sonde BacTaq 25 et 16S archées gènes ARNr ont été amplifiés avec des amorces Arc 349F et Arch 806R sonde et TM Arche 516F 26 dans les conditions suivantes: 95 ° C pendant 600 secondes , suivie de 45 cycles de 95 ° C pendant 30 secondes, 57 ° C pendant 60 s et 72 ° C pendant 25 secondes avec une extension finale à 40 ° C pendant 30 secondes. Toutes les réactions de qPCR ont été réalisées en double. Les 20 volumes de réaction de 20 ul inclus ng d'ADN, 10 uM d'amorces, 5 pM de la sonde, et 10 pi de mélange réactionnel de PCR quantitative. normes for qPCR bactérienne et Archaea ont été préparés en utilisant l' ADN génomique de Pseudomonas fluorescens et Halobacterium salinarum, respectivement. Les deux ont été cultivées jusqu'à la phase logarithmique. Chiffres de plaques ont été réalisées et l'ADN a été isolé à partir des cultures. L' ADN génomique a été quantifiée avec un spectrophotomètre avec l'hypothèse d'une et six copies du gène de l' ARNr 16S par génome de H. salinarum et P. fluorescens, respectivement 27-28. le nombre de copies des gènes bactériens et archées ont été calculées sur la base de la courbe standard, log-transformées pour tenir compte des variances inégales entre les traitements, et évalués par ANOVA.
Composition de la Communauté a été déterminée par séquençage du gène de l' ARNr 16S en utilisant des cellules d'écoulement et les technologies d'amplification en pont et en analysant les collectivités 'connaissances quantitatives en écologie microbienne »(29) QIIME. Avant et arrière se lit ont été jointes ensemble et ensuite séquences ont été filtrés, indexés,et des représentants de haute qualité ont été sélectionnés pour l'attribution de novo unités taxonomiques opérationnelles (OTU) par l'alignement de séquence avec une base de données de référence. séquences alignés ont été comparés à une base de données de référence séparée pour l'affectation taxonomique. Une table de OTU niveau phylum a été créé pour déterminer la composition de la communauté générale.
Protocol
Representative Results
Discussion
La cryosphère offre un accès à des organismes préservés qui ont persisté dans des conditions environnementales passées. Bien que les taxons récupéré peut ne pas représenter la communauté historique complète, ceux récupérés à partir de l' analyse des échantillons de glace et pergélisol glaciaires peuvent donner des informations historiques précieuses sur des périodes de temps sélectionnez 15-16. Par exemple, l' information biologique significatif a été établi à partir d' ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded through the U.S. Army Engineer Research and Development Center, Basic Research Program Office. Permission for publishing this information has been granted by the Chief of Engineers.
Materials
| Auger | Snow, Ice, and Permafrost Research Establishment (SIPRE), Fairbanks, AK | N/A | |
| 70% Isopropanol | Walmart | 551116880 | |
| 95% Ethyl Alcohol (denatured) | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | A407-4 | |
| DNA decontamination solution, DNA Away | Molecular Bio-Products, Inc., San Diego, CA | 7010 | |
| RNase decontamination solution, RNase Away | Molecular Bio-Products, Inc., San Diego, CA | 7002 | |
| Light Duty Suits | Kimberly-Clark Professional, Roswell, GA | 10606 | |
| Nitrile Gloves | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | FFS-700 | |
| Antiviral Masks | Curad, Walgreens | CUR3845 | |
| Sterile Sample Bags | Nasco, Fort Atkinson, WI | B01445 | |
| Steel Microtome Blade | B-Sharp Microknife, Wake Forest, NC | N/A | |
| Metal Rack | Fabricated at CRREL, Hanover, NH | N/A | |
| Tray | Handy Paint Products, Chanhassen, MN | 7500-CC | |
| Aluminum Foil | Western Plastics, Temecula, CA | N/A | |
| 500 ml Bottle with 0.22 μm Filter | Corning, Corning, NY | 430513 | |
| Serratia marcescens | ATCC, Manassas, VA | 17991 | |
| Biosafety Hood | NuAire, Plymouth, MN | NU-425-400 | |
| Petri Dish | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | FB0875712 | |
| ATCC Agar 181- Tryptone | Acros Organics, NJ | 61184-5000 | |
| ATCC Agar 181- Glucose | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP381-500 | |
| ATCC Agar 181- Yeast Extract | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP1422-500 | |
| ATCC Agar 181- Dipotassium Phosphate | JT Baker, Phillipsburg, NJ | 3252-01 | |
| ATCC Agar 181- Agar | Difco, Sparks, MD | 214530 | |
| NanoDrop 2000 UV Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE | ||
| Lightcycler 480 System | Roche Molecular Systems, Inc., Indianapolis, IN | ||
| Halobacterium salinarum | American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA | ||
| Pseudomonas fluorescens | American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA | ||
| Microbial DNA Isolation Kit | MoBio Laboratories, Carlsbad, CA | 12224-50 | |
| Ear Protection | Elvex | EP-201 | |
| Hard Hat | N/A | N/A | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Professional, Roswell, GA | 34705 | |
| Glass Wool | Pyrex | 430330 | |
| Ruler | N/A | N/A | |
| Weighing Tin | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 08-732-100 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich, St Louis, MO | S-9625 | |
| Potassium chloride | JT Baker, Phillipsburg, NJ | 3040-04 | |
| Potassium phosphate, monobasic | JT Baker, Phillipsburg, NJ | 3246-01 | |
| Potassium phosphate, dibasic | JT Baker, Phillipsburg, NJ | 3252-01 | |
| Sodium phosphate dibasic, anhydrous | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP332-500 | |
| 50 ml Centrifuge Tubes | Corning, Corning, NY | 4558 | |
| 2 ml Microcentrifuge Tubes | MoBio Laboratories, Carlsbad, CA | 1200-250-T | |
| 2 ml Ceramic Bead Tubes (1.4 mm) | MoBio Laboratories, Carlsbad, CA | 13113-50 | |
| Scoopula | Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE | 1437520 | |
| Balance | Ohaus, Parsippany, NJ | E12130 | |
| Diethylpyrocarbonate (DEPC) | Sigma Aldrich, St Louis, MO | D5758 | |
| Hexadecyltrimethylammoniabromide (CTAB) | Acros Organics, NJ | 22716-5000 | |
| Polyethylene glycol 8000 | Sigma Aldrich, St Louis, MO | P5413-1KG | |
| Phenol-chloroform-isoamyl alcohol (25:24:1) (pH 8) | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP1752-400 | |
| Centrifuge | Eppendorf, Hauppauge, NY | 5417R | |
| Chloroform-isoamyl alcohol (24:1) | Sigma Aldrich, St Louis, MO | C0549-1PT | |
| TE Buffer | Ambion (Thermo Fisher), Wilmington, DE | AM9860 | |
| Pipets | Rainin, Woburn, MA | Pipet Lite XLS, 2, 10, 200, 1nd 1000ul pipets | |
| Pipet tips | Rainin, Woburn, MA | Rainin LTS presterilized, low retention, filtered tips, 10, 20, 200, 1000ul | |
| Vortexor | Scientific Industries, Bohemia, NY | G-560 | |
| Vortex Adaptor | MoBio Laboratories, Carlsbad, CA | 13000-V1 | |
| Clear Bottle | Corning, Corning, NY | C1395500 | |
| Amber Bottle | Corning, Corning, NY | C5135250 | |
| Bottle Top Filters, 0.22um | Corning, Corning, NY | 430513 | |
| 60 mL Syringe | Becton, Dickenson and Company, Franklin Lakes, NJ | BD 309653 | |
| Millex Syringe filters, 0.22 μm | EMD Millipore, Billerica, MA | SLGV033RB | |
| 70% Ethanol | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP2818-500 | diluted & filter sterilized |
| Isotemp 100 L Oven | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 151030511 | |
| Cell Spreader | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 08-100-10 | |
| Disposable Inoculating Loops | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 22-363-602 |
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