古代生物群集抱いて内部を調査するための冷凍コアの外側部分からの外因性物質の除去
Summary
雪氷圏は過去の環境条件の下で持続保存生物へのアクセスを提供しています。プロトコルは、収集し、土壌や氷の永久凍土コアを除染するために提示されています。外因性コロニーとDNAの不在が検出された微生物は、掘削や処理からの材料ではなく、汚染を表すことを示唆しています。
Abstract
The cryosphere offers access to preserved organisms that persisted under past environmental conditions. In fact, these frozen materials could reflect conditions over vast time periods and investigation of biological materials harbored inside could provide insight of ancient environments. To appropriately analyze these ecosystems and extract meaningful biological information from frozen soils and ice, proper collection and processing of the frozen samples is necessary. This is especially critical for microbial and DNA analyses since the communities present may be so uniquely different from modern ones. Here, a protocol is presented to successfully collect and decontaminate frozen cores. Both the absence of the colonies used to dope the outer surface and exogenous DNA suggest that we successfully decontaminated the frozen cores and that the microorganisms detected were from the material, rather than contamination from drilling or processing the cores.
Introduction
雪氷圏（ 例えば 、永久凍土の土壌、氷の特徴、氷、雪、フィルン、氷は）過去の環境条件の下で持続する生物の種類に垣間見ることができます。これらの基板が堆積するので凍結保存古い何千年もの間、その微生物群集、数十〜数百することができますので、古代の環境条件を反映しています。適切にこれらの生態系を分析し、凍結した土壌や氷から意味のある生物学的情報を抽出するには、凍結試料の適切な回収方法や処理が必要です。 21世紀のための気候予測は北極と亜北極地域1における顕著な温暖化の可能性を示しているので、これは最も重要です。具体的には、インテリアアラスカやグリーンランドは、2100年2,3によってそれぞれ約5℃〜7℃で、温めることが期待されます。これは、大幅に土壌や水生微生物群集に影響を与えることが予想されるので、関連されます生物地球化学的プロセス。気温の上昇と変更された沈殿政権は、潜在的に厚く、季節解凍（アクティブ）につながる多くの地域2-5の永久凍土の劣化6,7、凍結した土壌の解凍、およびなどの大規模な氷体の融解をレイヤーを開始することが期待されていますグランドアイス、アイスウェッジ、および分離氷8。これは劇的にこれらの生態系における植物や動物の生物多様性に加えて、生物地球化学的属性を変更します。
氷河氷とsyngenetic永久凍土の堆積物と氷の特徴は、化学的および機能が形成された時にそこに住んでいたものを表す環境の生物学的証拠を閉じ込められています。たとえば、インテリアアラスカで、イリノイ州のウィスコンシンの両方が永久凍土が存在している熟成させ、特にこの永久凍土が存在IMPAの生物学的および地球化学的証拠を含む（YBP）の前に15万年に現代の出会い系からのユニークな場所を提供します生物多様性に関する過去の気候の変化のCT。その結果、これらの堆積物は何千年もかけて生物地球化学と生物多様性の記録を提供します。面積が低い沈降速度を有しており、氷河ではありませんでしたので、邪魔されずにサンプルが土壌断面に垂直に掘削やトンネルに水平掘削いずれかで、収集と分析のためにアクセス可能です。さらに重要なのは、大規模なレコードは、特にこの領域9-14で永久凍土のユニークな生物地球化学的特徴を強調することを存在します。具体的には、DNA分析のアプリケーションは両方現存し、古代の氷と永久凍土試料中の生物多様性の有無と程度を推定するためには、特定の生物による占領に古代の環境条件の連携や生息地の探査を可能にします。
各研究はdiffereを使用しても以前の研究では、50kのYBP 11、15-19に遡るサンプルから哺乳動物、植物や微生物の気候への影響を確認しました永久凍土や氷床コアを収集し、除染するためのntの方法論。特定の方法は、外来核酸はまた、試料から除去されたかどうかを明らかにしなかったもののいくつかの例において、掘削コアは、16、20-21を滅菌しました。他の研究では、細菌の分離株15（ 例えば 、 セラチア・マルセッセンス ）、ならびに蛍光ミクロスフェア22は、除染手順の有効性を測定するために使用されてきました。
この実験は、後方に約40kのYBPまでさかのぼる永久凍土サンプルから微生物群集を調査する大規模な研究の一部でした。研究のこの部分の具体的な目的は、成功した氷と永久凍土コアを除染することでした。我々の知る限り、いかなる方法論は、凍結されたコアの外側部分から外国の核酸および関連するヌクレアーゼを排除するために設計されたソリューションの使用を統合していません。これは、これらのソリューションはcommonlであるという事実にもかかわらずですyは、分子の実験のための実験装置を除染するために使用されます。
コアを除染した後、ゲノムDNAをグリフィスら 23及びトウらによって開発されたプロトコルを用いて抽出した。24、分光光度計を用いて定量し、反応あたり20 ngのを達成するために、無菌の、DNAを含まない水で希釈しました。 600秒間95℃で45サイクル行った：細菌の16S rRNA遺伝子は、rRNA遺伝子を、プライマーアーチ349Fとアーチ806Rと、以下の条件でTMアーチ516F 26をプローブで増幅したプライマー331Fおよび797Rで増幅し、BacTaq 25と古細菌の16Sをプローブしました。 30秒間、95℃、57℃60秒間、および72℃での30秒間の40℃での最終伸長で25秒間。すべてのqPCR反応は二連で行いました。 20μlの反応容量は、20 ngのDNA、プライマーの10μM、プローブの5μM、および定量PCR反応ミックス10μlのを含んでいました。標準FOR細菌および古細菌の定量PCRは、それぞれ、 シュードモナス・フルオレッセンスおよび好塩菌のsalinarumからのゲノムDNAを用いて調製しました。両方とも、数期まで成長させました。プレートカウントを実施し、DNAを培養物から単離しました。ゲノムDNAはH.ためのゲノム当たり16S rRNA遺伝子の1と6のコピーを仮定した分光光度計で定量しましたsalinarumとP.それぞれ27-28、 フルオレッ 。細菌および古細菌の遺伝子のコピー数は、標準曲線に基づいて計算された、治療間不等分散を考慮して対数変換し、ANOVAによって評価しました。
コミュニティ組成物は、16S rRNA遺伝子の配列を決定するフローセルと、ブリッジ増幅技術を使用し、「微生物の生態に定量的洞察'（QIIME）29でコミュニティを分析することによって決定しました。順方向および逆方向読み込みを接合し、その後の配列は、ろ過し、インデックス付けされました、高品質の代表者は、参照データベースとの配列アラインメントを経て新たに操作的分類単位（OTU）の割り当てのために選択しました。整列された配列は、分類学上の割り当てのための別個の基準データベースと比較しました。門レベルのOTUテーブルは、一般的なコミュニティの組成を決定するために作成されました。
Protocol
Representative Results
Discussion
雪氷圏は過去の環境条件の下で持続保存生物へのアクセスを提供しています。回収された分類群は完全な歴史的なコミュニティを表していないかもしれないが、氷河や永久凍土サンプルの分析から回収されたものは、選択期間15-16に関する貴重な歴史的な情報を得ることができます。例えば、意味のある生体情報は、解凍33の結果としての炭素循環プロセスを調査アイスグリ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded through the U.S. Army Engineer Research and Development Center, Basic Research Program Office. Permission for publishing this information has been granted by the Chief of Engineers.
Materials
| Auger | Snow, Ice, and Permafrost Research Establishment (SIPRE), Fairbanks, AK | N/A | |
| 70% Isopropanol | Walmart | 551116880 | |
| 95% Ethyl Alcohol (denatured) | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | A407-4 | |
| DNA decontamination solution, DNA Away | Molecular Bio-Products, Inc., San Diego, CA | 7010 | |
| RNase decontamination solution, RNase Away | Molecular Bio-Products, Inc., San Diego, CA | 7002 | |
| Light Duty Suits | Kimberly-Clark Professional, Roswell, GA | 10606 | |
| Nitrile Gloves | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | FFS-700 | |
| Antiviral Masks | Curad, Walgreens | CUR3845 | |
| Sterile Sample Bags | Nasco, Fort Atkinson, WI | B01445 | |
| Steel Microtome Blade | B-Sharp Microknife, Wake Forest, NC | N/A | |
| Metal Rack | Fabricated at CRREL, Hanover, NH | N/A | |
| Tray | Handy Paint Products, Chanhassen, MN | 7500-CC | |
| Aluminum Foil | Western Plastics, Temecula, CA | N/A | |
| 500 ml Bottle with 0.22 μm Filter | Corning, Corning, NY | 430513 | |
| Serratia marcescens | ATCC, Manassas, VA | 17991 | |
| Biosafety Hood | NuAire, Plymouth, MN | NU-425-400 | |
| Petri Dish | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | FB0875712 | |
| ATCC Agar 181- Tryptone | Acros Organics, NJ | 61184-5000 | |
| ATCC Agar 181- Glucose | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP381-500 | |
| ATCC Agar 181- Yeast Extract | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP1422-500 | |
| ATCC Agar 181- Dipotassium Phosphate | JT Baker, Phillipsburg, NJ | 3252-01 | |
| ATCC Agar 181- Agar | Difco, Sparks, MD | 214530 | |
| NanoDrop 2000 UV Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE | ||
| Lightcycler 480 System | Roche Molecular Systems, Inc., Indianapolis, IN | ||
| Halobacterium salinarum | American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA | ||
| Pseudomonas fluorescens | American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA | ||
| Microbial DNA Isolation Kit | MoBio Laboratories, Carlsbad, CA | 12224-50 | |
| Ear Protection | Elvex | EP-201 | |
| Hard Hat | N/A | N/A | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Professional, Roswell, GA | 34705 | |
| Glass Wool | Pyrex | 430330 | |
| Ruler | N/A | N/A | |
| Weighing Tin | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 08-732-100 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich, St Louis, MO | S-9625 | |
| Potassium chloride | JT Baker, Phillipsburg, NJ | 3040-04 | |
| Potassium phosphate, monobasic | JT Baker, Phillipsburg, NJ | 3246-01 | |
| Potassium phosphate, dibasic | JT Baker, Phillipsburg, NJ | 3252-01 | |
| Sodium phosphate dibasic, anhydrous | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP332-500 | |
| 50 ml Centrifuge Tubes | Corning, Corning, NY | 4558 | |
| 2 ml Microcentrifuge Tubes | MoBio Laboratories, Carlsbad, CA | 1200-250-T | |
| 2 ml Ceramic Bead Tubes (1.4 mm) | MoBio Laboratories, Carlsbad, CA | 13113-50 | |
| Scoopula | Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE | 1437520 | |
| Balance | Ohaus, Parsippany, NJ | E12130 | |
| Diethylpyrocarbonate (DEPC) | Sigma Aldrich, St Louis, MO | D5758 | |
| Hexadecyltrimethylammoniabromide (CTAB) | Acros Organics, NJ | 22716-5000 | |
| Polyethylene glycol 8000 | Sigma Aldrich, St Louis, MO | P5413-1KG | |
| Phenol-chloroform-isoamyl alcohol (25:24:1) (pH 8) | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP1752-400 | |
| Centrifuge | Eppendorf, Hauppauge, NY | 5417R | |
| Chloroform-isoamyl alcohol (24:1) | Sigma Aldrich, St Louis, MO | C0549-1PT | |
| TE Buffer | Ambion (Thermo Fisher), Wilmington, DE | AM9860 | |
| Pipets | Rainin, Woburn, MA | Pipet Lite XLS, 2, 10, 200, 1nd 1000ul pipets | |
| Pipet tips | Rainin, Woburn, MA | Rainin LTS presterilized, low retention, filtered tips, 10, 20, 200, 1000ul | |
| Vortexor | Scientific Industries, Bohemia, NY | G-560 | |
| Vortex Adaptor | MoBio Laboratories, Carlsbad, CA | 13000-V1 | |
| Clear Bottle | Corning, Corning, NY | C1395500 | |
| Amber Bottle | Corning, Corning, NY | C5135250 | |
| Bottle Top Filters, 0.22um | Corning, Corning, NY | 430513 | |
| 60 mL Syringe | Becton, Dickenson and Company, Franklin Lakes, NJ | BD 309653 | |
| Millex Syringe filters, 0.22 μm | EMD Millipore, Billerica, MA | SLGV033RB | |
| 70% Ethanol | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP2818-500 | diluted & filter sterilized |
| Isotemp 100 L Oven | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 151030511 | |
| Cell Spreader | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 08-100-10 | |
| Disposable Inoculating Loops | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 22-363-602 |
References
- Solomon, S., et al. . Climate Change 2007: The Physical Science Basis. , (2007).
- Marchenko, S., Romanovsky, V., Tipenko, G. Numerical Modeling of Spatial Permafrost Dynamics in Alaska. Proc. Ninth Int. Conferen. Permafr. 29, 1125-1130 (2008).
- Pachauri, R. K., Meyer, L. A. . Climate Change 2014: Synthesis Report. Contributions of Working Groups I, II, and III to the Fifth Assessment Report of the Intergovernmental Panel on Climate Change. , (2007).
- Osterkamp, T. E., Romanovsky, V. E. Evidence for warming and thawing of discontinuous permafrost in Alaska. Permafr. Periglac. Process. 10 (1), 17-37 (1999).
- Wolken, J. M., et al. Evidence and implications of recent and projected climate change in Alaska’s forest ecosystems. Ecosphere. 2 (11), 1-35 (2011).
- Hinzman, L. D., Kane, D. L., Gieck, R. E., Everett, K. R. Hydrologic and thermal properties of the active layer in the Alaskan Arctic. Cold Reg. Sci. Technol. 19 (2), 95-110 (1991).
- Hinzman, L. D., Goering, D. J., Kane, D. L. A distributed thermal model for calculating temperature profiles and depth of thaw in permafrost regions. J. Geophys. Res.: Atmos. 103 (D22), 28975-28991 (1998).
- Osterkamp, T. E., Jorgenson, J. C. Warming of Permafrost in the Arctic National Wildlife Refuge. Alaska. Permafr. Periglac. Process. 17, 65-69 (2006).
- Petrone, K. C., Jones, J. B., Hinzman, L. D., Boone, R. D. Seasonal export of carbon, nitrogen, and major solutes from Alaskan catchments with discontinuous permafrost. J. Geophys. Res. 111, G02020 (2006).
- Guo, L., Ping, C. -. L., Macdonald, R. W. Mobilization pathways of organic carbon from permafrost to arctic rivers in a changing climate. Geophys. Res. Lett. 34 (13), L13603 (2007).
- Katayama, T., et al. Phylogenetic analysis of bacteria preserved in a permafrost ice wedge for 25,000 years. Appl. Environ. Microbiol. 73 (7), 2360-2363 (2007).
- Katayama, T., et al. Glaciibacter superstes gen. nov., sp. nov., a novel member of the family Microbacteriaceae isolated from a permafrost ice wedge. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 59, 482-486 (2009).
- Waldrop, M. P., White, R., Douglas, T. A. Isolation and identification of cold-adapted fungi in the Fox Permafrost Tunnel, Alaska. Proc. Ninth Int. Conferen. Permafr. , 1887-1891 (2008).
- Douglas, T. A., et al. Biogeochemical and geocryological characteristics of wedge and thermokarst-cave ice in the CRREL Permafrost Tunnel. Alaska Permafr. Periglac. Process. 21 (2), 120-128 (2011).
- Willerslev, E., et al. Diverse plant and animal genetic records from Holocene and Pleistocene sediments. Science. 300 (5620), 791-795 (2003).
- Bellemain, E., et al. Fungal palaeodiversity revealed using high-throughput metabarcoding of ancient DNA from Arctic permafrost. Environ. Microbiol. 15 (4), 1176-1189 (2013).
- Steven, B., Pollard, W. H., Greer, C. W., Whyte, L. G. Microbial diversity and activity through a permafrost/ground ice core profile from the Canadian high Arctic. Environ. Microbiol. 10 (12), 3388-3403 (2008).
- Lorenzen, E. D., et al. Species-specific responses of Late Quaternary megafauna to climate and humans. Nature. 479 (7373), 359-364 (2011).
- Wilhelm, R. C., Radtke, K., Mykytczuk, N. C. S., Greer, C. W., Whyte, L. G. Life at the wedge: The activity and diversity of Arctic ice wedge microbial communities. Astrobiol. 12 (4), 347-360 (2012).
- Sheriden, P. P., Miteva, V. I., Brenchley, J. E. Phylogenetic analysis of anaerobic psychrophilic enrichment cultures obtained from a Greenland glacier ice core. Appl. Environ. Microbiol. 69 (4), 2153-2160 (2003).
- Rivkina, E., et al. Biogeochemistry of methane and methanogenic archaea in permafrost. FEMS Microbiol. Ecol. 61 (1), 1-15 (2007).
- Juck, D. F., et al. Utilization of fluorescent microspheres and a green fluorescent protein-marked strain for assessment of microbiological contamination of permafrost and ground ice core samples from the Canadian High Arctic. Appl. Environ. Microbiol. 71 (2), 1035-1041 (2005).
- Griffiths, R. I., Whiteley, A. S., O’Donnell, A. G., Bailey, M. J. Rapid method for coextraction of DNA and RNA from natural environments for analysis of ribosomal DNA- and rRNA-based microbial community composition. Appl. Environ. Microbiol. 66 (12), 5488-5491 (2000).
- Töwe, S., et al. Improved protocol for the simultaneous extraction and column-based separation of DNA and RNA from different soils. J. Microbiol. Methods. 84 (3), 406-412 (2011).
- Nadkarni, M. A., Martin, F. E., Jacques, N. A., Hunter, N. Determination of bacterial load by real-time PCR using a broad range (universal) probe and primers set. Microbiol. 148, 257-266 (2002).
- Takai, K., Horikoshi, K. Rapid detection and quantification of members of the archaeal community by quantitative PCR using fluorogenic probes. Appl. Environ. Microbiol. 66 (11), 5066-5072 (2000).
- Fogel, G. B., Collins, C. R., Brunk, C. F. Prokaryotic genome size and SSU rDNA copy number: Estimation of microbial relative abundance from a mixed population. Microb. Ecol. 38, 93-113 (1999).
- Bodilis, J., Nsigue-Meilo, S., Besaury, L., Quillet, L. Variable copy number, intra-genomic heterogeneities and later transfers of the 16S rRNA gene in Pseudomonas. PLOS One. 7, e35647 (2012).
- Caporaso, J. G., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature Methods. 7, 335-336 (2010).
- Sellmann, P. V. . Geology of the USA CRREL permafrost tunnel, Fairbanks, Alaska. US Army Cold Reg. Res. Eng. Lab. Technical Rep. 199. , (1967).
- Sellmann, P. V. . Additional information on the geology and properties of materials exposed in the USA CRREL permafrost tunnel. US Army CRREL Special Rep. , (1972).
- Christner, B. C., Mikucki, J. A., Foreman, C. M., Denson, J., Priscu, J. C. Glacial ice cores: A model system for developing extraterrestrial decontamination protocols. Icarus. 174 (2), 572-584 (2005).
- Mackelprang, R., et al. Metagenomic analysis of a permafrost microbial community reveals a rapid response to thaw. Nature. 480 (7377), 368-371 (2011).
- Champlot, S., et al. An efficient multistrategy DNA decontamination of PCR reagents for hyper sensitive PCR applications. PLoS One. 5 (9), e13042 (2010).
- Yergeau, E., Hogues, H., Whyte, L. G., Greer, C. W. The functional potential of high Arctic permafrost revealed by metagenomic sequencing, qPCR, and microarray analyses. The ISME J. 4 (9), 1206-1214 (2010).
- Welzl, G., Schloter, M. Bacterial community structure in soils of the Tibetan Plateau affected by discontinuous permafrost or seasonal freezing. Biol. Fertil. Soils. 50 (3), 555-559 (2014).
- Vishnivetskaya, T. A., et al. Commercial DNA extraction kits impact observed microbial community composition in permafrost samples. FEMS Microbiol. Ecol. 87 (1), 217-230 (2014).
- Wagner, D., Kobabe, S., Liebner, S. Bacterial community structure and carbon turnover in permafrost-affected soils of the Lena Delta, northeastern Siberia. Can. J. Microbiol. 55 (1), 73-83 (2009).
- Jiang, N., et al. Characteristic microbial communities in the continuous permafrost beside the bitumen in Qinghai-Tibetan Plateau. Environ. Earth Sci. 74, 1343-1352 (2015).
