Fjernelse af Eksogene Materialer fra den ydre del af frosne kerner at undersøge den gamle biologiske samfund nærede Inside
Summary
Kryosfæren giver adgang til bevarede organismer, der varede under tidligere miljøforhold. En protokol præsenteres til at indsamle og rense permafrost kerner af jord og is. Fravær af exogene kolonier og DNA tyder på, at mikroorganismer detekteret repræsenterer materialet, snarere end forurening fra boring eller forarbejdning.
Abstract
The cryosphere offers access to preserved organisms that persisted under past environmental conditions. In fact, these frozen materials could reflect conditions over vast time periods and investigation of biological materials harbored inside could provide insight of ancient environments. To appropriately analyze these ecosystems and extract meaningful biological information from frozen soils and ice, proper collection and processing of the frozen samples is necessary. This is especially critical for microbial and DNA analyses since the communities present may be so uniquely different from modern ones. Here, a protocol is presented to successfully collect and decontaminate frozen cores. Both the absence of the colonies used to dope the outer surface and exogenous DNA suggest that we successfully decontaminated the frozen cores and that the microorganisms detected were from the material, rather than contamination from drilling or processing the cores.
Introduction
Den kryosfære (f.eks permafrost jord, is funktioner, iskold sne, firn og is) giver et indblik i, hvilke typer af organismer varede under tidligere miljøforhold. Da disse substrater kan være ti til hundrede tusinder af år gamle, deres mikrobielle samfund, når konserverede frosne siden aflejring, afspejler gamle miljøforhold. For passende analysere disse økosystemer og udtrække meningsfulde biologiske oplysninger frosne jord og is, korrekt indsamling og behandling af de frosne prøver er nødvendig. Dette er af allerstørste betydning, da klima- fremskrivninger for det 21. århundrede viser potentiale for en markant opvarmning i Arktis og subarktiske områder 1. Konkret Interiør Alaska og Grønland forventes at varme ca. 5 ° C og 7 ° C, henholdsvis i 2100 2,3. Dette forventes at få væsentlig indvirkning jorden og vandområder mikrobielle samfund, og derfor relateretbiogeokemiske processer. De varmere temperaturer og ændret nedbør regime forventes at indlede permafrost nedbrydning i mange områder 2-5 kan føre til en tykkere, sæsonmæssigt optøet (aktiv) lag 6,7, optøning af frosne jord, og smeltning af massive is organer såsom jorden is, is kiler, og segregation is 8. Dette ville dramatisk ændre de biogeokemiske attributter ud over den biologiske mangfoldighed af planter og dyr i disse økosystemer.
Glacial is og syngenetic permafrost sediment og is funktioner har fanget kemiske og biologiske beviser for et miljø, der repræsenterer, hvad der boede der på det tidspunkt, de funktioner dannet. For eksempel i Interior Alaska, både Illinoisan og Wisconsin alderen permafrost er til stede, og denne permafrost især giver unikke steder stammer fra moderne til 150.000 år før den nuværende (YBP), der indeholder biologiske og geokemiske dokumentation for IMPAct af tidligere klimatiske ændringer på biodiversiteten. Som et resultat, disse sedimenter giver en rekord i biogeokemisk og biodiversitet gennem mange tusinde år. Da området har lav sedimentation satser og har aldrig været isdækkede, uforstyrrede prøver er tilgængelige for indsamling og analyse, enten boring lodret i jorden profil eller boring horisontalt i tunneler. Endnu vigtigere er, findes der omfattende registre, at især fremhæve de unikke biogeokemiske funktioner i permafrost i denne region 9-14. Konkret til anvendelsen af DNA-analyse estimere tilstedeværelse og omfanget af den biologiske mangfoldighed i både bevarede og gamle is og permafrost prøver muliggør udforskning af sammenkædning af gamle miljøforhold og levested til besættelse af særlige organismer.
Tidligere undersøgelser har identificeret klimatiske påvirkninger af pattedyr, planter og mikroorganismer fra prøver dating til 50k YBP 11, 15-19, selvom hver undersøgelse brugte en Forskelnt metodologi til at indsamle og rense permafrosten eller iskerner. I nogle tilfælde blev borekerner steriliseret 16, 20-21, selvom den specifikke metode ikke afklare, om fremmede nukleinsyrer blev også slået fra prøverne. I andre undersøgelser bakterielle isolater 15 (fx Serratia marcescens) samt fluorescerende mikrokugler 22 er blevet anvendt til at måle effekten af rensningsprocesser.
Dette eksperiment var en del af en større undersøgelse undersøger mikrobielle samfund fra permafrosten prøver dateres tilbage til ca. 40 k YBP. Det specifikke mål med denne del af undersøgelsen var at succes rense is og permafrost kerner. Så vidt vi ved, har ingen metode integreret anvendelse af løsninger designet til at eliminere fremmede nukleinsyrer og associerede nukleaser fra den ydre del af de frosne kerner. Dette er til trods for, at disse løsninger er commonly anvendes til dekontaminering af laboratorieudstyr til molekylære eksperimenter.
Når kernerne blev dekontamineret, blev genomisk DNA ekstraheret under anvendelse af de protokoller, der er udviklet af Griffiths et al. 23 og Towe et al. 24, kvantificeret ved anvendelse af et spektrofotometer, og fortyndet med sterilt, DNA-frit vand for at opnå 20 ng per reaktion. Bakterielle 16S rRNA-generne blev forstærket med primere 331F og 797R og sonde BacTaq 25 og arke 16S rRNA-generne blev forstærket med primere Arch 349F og Arch 806R og sonde TM Arch 516F 26 under følgende betingelser: 95 ° C i 600 sek efterfulgt af 45 cykler på 95 ° C i 30 sek, 57 ° C i 60 sek og 72 ° C i 25 sek med endelig ekstension ved 40 ° C i 30 sek. Alle qPCR Reaktionerne blev udført in duplo. De 20 pi reaktionsvolumener inkluderet 20 ng DNA, 10 pM af primerne, 5 pM af sonden, og 10 pi af qPCR reaktionsblandingen. standarder for bakteriel og archaeorganisme qPCR blev fremstillet under anvendelse af genomisk DNA fra Pseudomonas fluorescens og Halobacterium salinarum hhv. Begge blev dyrket til logaritmisk fase. Pladetællinger blev udført, og DNA blev isoleret fra kulturerne. Genomisk DNA blev kvantificeret med et spektrofotometer under antagelse af en og seks kopier af 16S rRNA-genet pr genom for H. salinarum og P. fluorescens, henholdsvis 27-28. Kopier numrene på de bakterielle og arke gener blev beregnet på grundlag af standardkurven, log-transformeret til regnskab for ulige afvigelser mellem behandlingerne, og vurderet af ANOVA.
EF-sammensætning blev bestemt ved sekventering af 16S rRNA-genet ved hjælp af flow celler og bro forstærkning teknologier og analysere de samfund med »kvantitative indsigt i mikrobiel økologi" (QIIME) 29. Frem og bak læser blev forenet sammen og derefter sekvenser blev filtreret, indekseret,og repræsentanter af høj kvalitet blev udvalgt til de novo operationelle taksonomiske enheder (OTU) opgave gennem sekvens alignment med en reference-database. Opstillede sekvenser blev sammenlignet med en separat referencedatabase for taksonomisk opgave. En phylum niveau OTU tabel blev oprettet for at bestemme generelle samfund sammensætning.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kryosfæren giver adgang til bevarede organismer, der varede under tidligere miljøforhold. Selvom den genvundne taxa kan ikke repræsentere den fuldstændige historiske samfund, kan de inddrives fra analyse af glaciale is og permafrost prøver give værdifulde historiske oplysninger om udvalgte tidsperioder 15-16. For eksempel har meningsfuld biologisk information blevet trukket fra is studier undersøger anaerob aktivitet i Grønland indlandsis 20 og permafrost studier der undersøger kulstof cyk…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded through the U.S. Army Engineer Research and Development Center, Basic Research Program Office. Permission for publishing this information has been granted by the Chief of Engineers.
Materials
| Auger | Snow, Ice, and Permafrost Research Establishment (SIPRE), Fairbanks, AK | N/A | |
| 70% Isopropanol | Walmart | 551116880 | |
| 95% Ethyl Alcohol (denatured) | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | A407-4 | |
| DNA decontamination solution, DNA Away | Molecular Bio-Products, Inc., San Diego, CA | 7010 | |
| RNase decontamination solution, RNase Away | Molecular Bio-Products, Inc., San Diego, CA | 7002 | |
| Light Duty Suits | Kimberly-Clark Professional, Roswell, GA | 10606 | |
| Nitrile Gloves | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | FFS-700 | |
| Antiviral Masks | Curad, Walgreens | CUR3845 | |
| Sterile Sample Bags | Nasco, Fort Atkinson, WI | B01445 | |
| Steel Microtome Blade | B-Sharp Microknife, Wake Forest, NC | N/A | |
| Metal Rack | Fabricated at CRREL, Hanover, NH | N/A | |
| Tray | Handy Paint Products, Chanhassen, MN | 7500-CC | |
| Aluminum Foil | Western Plastics, Temecula, CA | N/A | |
| 500 ml Bottle with 0.22 μm Filter | Corning, Corning, NY | 430513 | |
| Serratia marcescens | ATCC, Manassas, VA | 17991 | |
| Biosafety Hood | NuAire, Plymouth, MN | NU-425-400 | |
| Petri Dish | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | FB0875712 | |
| ATCC Agar 181- Tryptone | Acros Organics, NJ | 61184-5000 | |
| ATCC Agar 181- Glucose | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP381-500 | |
| ATCC Agar 181- Yeast Extract | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP1422-500 | |
| ATCC Agar 181- Dipotassium Phosphate | JT Baker, Phillipsburg, NJ | 3252-01 | |
| ATCC Agar 181- Agar | Difco, Sparks, MD | 214530 | |
| NanoDrop 2000 UV Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE | ||
| Lightcycler 480 System | Roche Molecular Systems, Inc., Indianapolis, IN | ||
| Halobacterium salinarum | American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA | ||
| Pseudomonas fluorescens | American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA | ||
| Microbial DNA Isolation Kit | MoBio Laboratories, Carlsbad, CA | 12224-50 | |
| Ear Protection | Elvex | EP-201 | |
| Hard Hat | N/A | N/A | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Professional, Roswell, GA | 34705 | |
| Glass Wool | Pyrex | 430330 | |
| Ruler | N/A | N/A | |
| Weighing Tin | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 08-732-100 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich, St Louis, MO | S-9625 | |
| Potassium chloride | JT Baker, Phillipsburg, NJ | 3040-04 | |
| Potassium phosphate, monobasic | JT Baker, Phillipsburg, NJ | 3246-01 | |
| Potassium phosphate, dibasic | JT Baker, Phillipsburg, NJ | 3252-01 | |
| Sodium phosphate dibasic, anhydrous | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP332-500 | |
| 50 ml Centrifuge Tubes | Corning, Corning, NY | 4558 | |
| 2 ml Microcentrifuge Tubes | MoBio Laboratories, Carlsbad, CA | 1200-250-T | |
| 2 ml Ceramic Bead Tubes (1.4 mm) | MoBio Laboratories, Carlsbad, CA | 13113-50 | |
| Scoopula | Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE | 1437520 | |
| Balance | Ohaus, Parsippany, NJ | E12130 | |
| Diethylpyrocarbonate (DEPC) | Sigma Aldrich, St Louis, MO | D5758 | |
| Hexadecyltrimethylammoniabromide (CTAB) | Acros Organics, NJ | 22716-5000 | |
| Polyethylene glycol 8000 | Sigma Aldrich, St Louis, MO | P5413-1KG | |
| Phenol-chloroform-isoamyl alcohol (25:24:1) (pH 8) | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP1752-400 | |
| Centrifuge | Eppendorf, Hauppauge, NY | 5417R | |
| Chloroform-isoamyl alcohol (24:1) | Sigma Aldrich, St Louis, MO | C0549-1PT | |
| TE Buffer | Ambion (Thermo Fisher), Wilmington, DE | AM9860 | |
| Pipets | Rainin, Woburn, MA | Pipet Lite XLS, 2, 10, 200, 1nd 1000ul pipets | |
| Pipet tips | Rainin, Woburn, MA | Rainin LTS presterilized, low retention, filtered tips, 10, 20, 200, 1000ul | |
| Vortexor | Scientific Industries, Bohemia, NY | G-560 | |
| Vortex Adaptor | MoBio Laboratories, Carlsbad, CA | 13000-V1 | |
| Clear Bottle | Corning, Corning, NY | C1395500 | |
| Amber Bottle | Corning, Corning, NY | C5135250 | |
| Bottle Top Filters, 0.22um | Corning, Corning, NY | 430513 | |
| 60 mL Syringe | Becton, Dickenson and Company, Franklin Lakes, NJ | BD 309653 | |
| Millex Syringe filters, 0.22 μm | EMD Millipore, Billerica, MA | SLGV033RB | |
| 70% Ethanol | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | BP2818-500 | diluted & filter sterilized |
| Isotemp 100 L Oven | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 151030511 | |
| Cell Spreader | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 08-100-10 | |
| Disposable Inoculating Loops | Fisher Scientific, Pittsburgh, PA | 22-363-602 |
References
- Solomon, S., et al. . Climate Change 2007: The Physical Science Basis. , (2007).
- Marchenko, S., Romanovsky, V., Tipenko, G. Numerical Modeling of Spatial Permafrost Dynamics in Alaska. Proc. Ninth Int. Conferen. Permafr. 29, 1125-1130 (2008).
- Pachauri, R. K., Meyer, L. A. . Climate Change 2014: Synthesis Report. Contributions of Working Groups I, II, and III to the Fifth Assessment Report of the Intergovernmental Panel on Climate Change. , (2007).
- Osterkamp, T. E., Romanovsky, V. E. Evidence for warming and thawing of discontinuous permafrost in Alaska. Permafr. Periglac. Process. 10 (1), 17-37 (1999).
- Wolken, J. M., et al. Evidence and implications of recent and projected climate change in Alaska’s forest ecosystems. Ecosphere. 2 (11), 1-35 (2011).
- Hinzman, L. D., Kane, D. L., Gieck, R. E., Everett, K. R. Hydrologic and thermal properties of the active layer in the Alaskan Arctic. Cold Reg. Sci. Technol. 19 (2), 95-110 (1991).
- Hinzman, L. D., Goering, D. J., Kane, D. L. A distributed thermal model for calculating temperature profiles and depth of thaw in permafrost regions. J. Geophys. Res.: Atmos. 103 (D22), 28975-28991 (1998).
- Osterkamp, T. E., Jorgenson, J. C. Warming of Permafrost in the Arctic National Wildlife Refuge. Alaska. Permafr. Periglac. Process. 17, 65-69 (2006).
- Petrone, K. C., Jones, J. B., Hinzman, L. D., Boone, R. D. Seasonal export of carbon, nitrogen, and major solutes from Alaskan catchments with discontinuous permafrost. J. Geophys. Res. 111, G02020 (2006).
- Guo, L., Ping, C. -. L., Macdonald, R. W. Mobilization pathways of organic carbon from permafrost to arctic rivers in a changing climate. Geophys. Res. Lett. 34 (13), L13603 (2007).
- Katayama, T., et al. Phylogenetic analysis of bacteria preserved in a permafrost ice wedge for 25,000 years. Appl. Environ. Microbiol. 73 (7), 2360-2363 (2007).
- Katayama, T., et al. Glaciibacter superstes gen. nov., sp. nov., a novel member of the family Microbacteriaceae isolated from a permafrost ice wedge. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 59, 482-486 (2009).
- Waldrop, M. P., White, R., Douglas, T. A. Isolation and identification of cold-adapted fungi in the Fox Permafrost Tunnel, Alaska. Proc. Ninth Int. Conferen. Permafr. , 1887-1891 (2008).
- Douglas, T. A., et al. Biogeochemical and geocryological characteristics of wedge and thermokarst-cave ice in the CRREL Permafrost Tunnel. Alaska Permafr. Periglac. Process. 21 (2), 120-128 (2011).
- Willerslev, E., et al. Diverse plant and animal genetic records from Holocene and Pleistocene sediments. Science. 300 (5620), 791-795 (2003).
- Bellemain, E., et al. Fungal palaeodiversity revealed using high-throughput metabarcoding of ancient DNA from Arctic permafrost. Environ. Microbiol. 15 (4), 1176-1189 (2013).
- Steven, B., Pollard, W. H., Greer, C. W., Whyte, L. G. Microbial diversity and activity through a permafrost/ground ice core profile from the Canadian high Arctic. Environ. Microbiol. 10 (12), 3388-3403 (2008).
- Lorenzen, E. D., et al. Species-specific responses of Late Quaternary megafauna to climate and humans. Nature. 479 (7373), 359-364 (2011).
- Wilhelm, R. C., Radtke, K., Mykytczuk, N. C. S., Greer, C. W., Whyte, L. G. Life at the wedge: The activity and diversity of Arctic ice wedge microbial communities. Astrobiol. 12 (4), 347-360 (2012).
- Sheriden, P. P., Miteva, V. I., Brenchley, J. E. Phylogenetic analysis of anaerobic psychrophilic enrichment cultures obtained from a Greenland glacier ice core. Appl. Environ. Microbiol. 69 (4), 2153-2160 (2003).
- Rivkina, E., et al. Biogeochemistry of methane and methanogenic archaea in permafrost. FEMS Microbiol. Ecol. 61 (1), 1-15 (2007).
- Juck, D. F., et al. Utilization of fluorescent microspheres and a green fluorescent protein-marked strain for assessment of microbiological contamination of permafrost and ground ice core samples from the Canadian High Arctic. Appl. Environ. Microbiol. 71 (2), 1035-1041 (2005).
- Griffiths, R. I., Whiteley, A. S., O’Donnell, A. G., Bailey, M. J. Rapid method for coextraction of DNA and RNA from natural environments for analysis of ribosomal DNA- and rRNA-based microbial community composition. Appl. Environ. Microbiol. 66 (12), 5488-5491 (2000).
- Töwe, S., et al. Improved protocol for the simultaneous extraction and column-based separation of DNA and RNA from different soils. J. Microbiol. Methods. 84 (3), 406-412 (2011).
- Nadkarni, M. A., Martin, F. E., Jacques, N. A., Hunter, N. Determination of bacterial load by real-time PCR using a broad range (universal) probe and primers set. Microbiol. 148, 257-266 (2002).
- Takai, K., Horikoshi, K. Rapid detection and quantification of members of the archaeal community by quantitative PCR using fluorogenic probes. Appl. Environ. Microbiol. 66 (11), 5066-5072 (2000).
- Fogel, G. B., Collins, C. R., Brunk, C. F. Prokaryotic genome size and SSU rDNA copy number: Estimation of microbial relative abundance from a mixed population. Microb. Ecol. 38, 93-113 (1999).
- Bodilis, J., Nsigue-Meilo, S., Besaury, L., Quillet, L. Variable copy number, intra-genomic heterogeneities and later transfers of the 16S rRNA gene in Pseudomonas. PLOS One. 7, e35647 (2012).
- Caporaso, J. G., et al. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data. Nature Methods. 7, 335-336 (2010).
- Sellmann, P. V. . Geology of the USA CRREL permafrost tunnel, Fairbanks, Alaska. US Army Cold Reg. Res. Eng. Lab. Technical Rep. 199. , (1967).
- Sellmann, P. V. . Additional information on the geology and properties of materials exposed in the USA CRREL permafrost tunnel. US Army CRREL Special Rep. , (1972).
- Christner, B. C., Mikucki, J. A., Foreman, C. M., Denson, J., Priscu, J. C. Glacial ice cores: A model system for developing extraterrestrial decontamination protocols. Icarus. 174 (2), 572-584 (2005).
- Mackelprang, R., et al. Metagenomic analysis of a permafrost microbial community reveals a rapid response to thaw. Nature. 480 (7377), 368-371 (2011).
- Champlot, S., et al. An efficient multistrategy DNA decontamination of PCR reagents for hyper sensitive PCR applications. PLoS One. 5 (9), e13042 (2010).
- Yergeau, E., Hogues, H., Whyte, L. G., Greer, C. W. The functional potential of high Arctic permafrost revealed by metagenomic sequencing, qPCR, and microarray analyses. The ISME J. 4 (9), 1206-1214 (2010).
- Welzl, G., Schloter, M. Bacterial community structure in soils of the Tibetan Plateau affected by discontinuous permafrost or seasonal freezing. Biol. Fertil. Soils. 50 (3), 555-559 (2014).
- Vishnivetskaya, T. A., et al. Commercial DNA extraction kits impact observed microbial community composition in permafrost samples. FEMS Microbiol. Ecol. 87 (1), 217-230 (2014).
- Wagner, D., Kobabe, S., Liebner, S. Bacterial community structure and carbon turnover in permafrost-affected soils of the Lena Delta, northeastern Siberia. Can. J. Microbiol. 55 (1), 73-83 (2009).
- Jiang, N., et al. Characteristic microbial communities in the continuous permafrost beside the bitumen in Qinghai-Tibetan Plateau. Environ. Earth Sci. 74, 1343-1352 (2015).
