Summary
Målet med denne protokol er at ikke-invasivt vurdere hjerte-strukturelle og funktionelle ændringer i en musemodel for hjertesygdomme skabt af tværgående aorta konstriktion, hjælp B- og M-mode ekkokardiografi og farve / puls bølge Doppler billeddannelse.
Protocol
Protokollen følger retningslinjerne fra Institutional Animal Care og brug Udvalg University of Washington.
1. Kirurgisk Procedure og Forberedelse til Imaging
- Om C57BL / 6-mus til TAC eller skinkirurgi som tidligere beskrevet 10.
- En uge efter TAC eller skinkirurgi, bedøver musen i induktionen kammer med 2% isofluran blandet med 1 l / min O 2. Bekræft ordentlig bedøvelse ved manglende respons til tå eller hale klemme. Brug veterinær salve på øjnene for at forhindre tørhed, mens under anæstesi. Fjern hår på brystet ved at anvende hårfjerning creme. Desinficere musehud med 70% ethanol.
- Fastgør musen til et dyr håndtering platform i liggende stilling. For at opretholde et stabilt niveau af anæstesi, brug en næsekegle at levere 0,5-1% isofluran blandet med 1 l / min O 2.
- Påfør elektrode gel til poter musen og tape dem til elektroden pad.
- Indsæt en rektal sonde til at overvåge kropstemperaturen. Opretholde kroppens temperatur ved 37 ° C via en varmepude eller en lampe.
- Påfør et lag foropvarmet ultralyd gel til muse bryst, hovedsagelig området ligger over hjertet. Bemærk: Fjern ultralyd gel og tør mus med steril gaze efter imaging procedure.
2. I aortabuen View, Brug B-mode og Doppler Imaging at evaluere Tværgående pulsåresammensnøring
- Brug indstillingen for B-mode for at opnå aortabuen visningen for at visualisere aorta, store arterielle grene, og indsnævringen webstedet.
- Vip venstre side af platformen op så vidt muligt at rotere musen til venstre decubitus position. Hold ultralyd transducer ved standen i lodret position og placere den på brystet langs højre parasternal linje, med hakket pegende mod hagen af musen. Bemærk: Du må ikke komprimere musen thorax ved sænkning af transducer; minimal mængde tryk er påkrævet.
- Vip transduceren op på niveauet for scapula og rotere lidt med uret, indtil aortabuen kommer til syne. Observere den tværgående pulsåresammensnøring site, som er placeret mellem forgreningen af innominate arterie (IA) og venstre arteria carotis communis (LCCA) (figur 1).
Bemærk: Ingen indsnævring detekteres i sham-opererede mus.
- Klik på "farve Doppler" knappen på arbejdsstationen for at skifte til farve Doppler-tilstand til at overvåge retningsbestemmelse og hastigheden af blodgennemstrømningen i hele indsnævringen webstedet. Anskaf og gemme billeder ved at klikke på "Cine butikken" knappen.
- Klik på knappen "PW Doppler" for at skifte til puls bølge Doppler-tilstand, og sted prøvevolumen (den stiplede cursor boks) umiddelbart distalt for konstriktion websted for at søge efter den stenotiske jet med den højeste hastighed, klik derefter på knappen "PW Doppler" til opnåelse bølgeformer af aorta flow og måle den maksimale hastighed (figur 2).
- Beregn trykgradient over forsnævringen websted ved hjælp af den modificerede Bernoullis ligning: trykgradient = 4 x V max 2. omfatter kun mus med en trykgradient i området fra 40 til 80 mmHg for yderligere analyse.
3. I parasternal Lang Axis View, Brug B-mode og M-mode Imaging at vurdere hjertefunktionen Dimensioner og Kontraktilitet
- Med musen liggende i rygleje på platformen, holde transduceren i lodret mode med hakket peger på musens hoved. Sænk transduceren på brystkassen parallelt med den venstre parasternal linje og rotere 30 ° mod uret.
- Brug B-mode scanning for at opnå en fuld lang akse "sagittal" syn på hjertet. Justere vinklen på transduceren og fokus dybde til at visualisere venstre ventrikel, den intraventrikulære septale væg, og en let del af den højre ventrikulære væg. Save billederne til senere undersøgelser af hjertefunktionen vægtykkelse og kammer dimension. Brug af "cardiac pakke", vælge parametre såsom IVS eller LVAW, LVID, og LVPW og derefter klik på billedet for at tegne tilsvarende linjer for hver parameter for at opnå målingerne.
- Overhold hjerte-væg bevægelsesmønstre og tjekke for mulige bevægelse abnormiteter, herunder akinesi, hypokinesi, og asynkron.
Bemærk: Akinesia og hypokinesi betegne fuldstændig og delvis tab af bevægelse af hjertets væg hhv. Asynkron betegner uregelmæssig, ukoordineret hjerte-væg bevægelse. - Skift til M-mode, sted M-mode markøren vinkelret på LV vægge på niveauet for den papillære muskel og hente billeder til senere måling af cardiac dimensioner og fraktioneret afkortning (figur 3).
4. I parasternal Short Axis View, Brug B-mode og M-mode Imaging at vurdere hjertefunktionen morfologi og funktion
- from den parasternal lange akse visning, få parasternal korte akse visning ved at dreje transduceren 90 ° med uret. Juster transduceren til at give et horisontalt tværsnit "tværgående" syn på hjertet i B-tilstand, med begge papillarmuskler klart synlige og placeret til højre (den 2 og 4:00 position).
- Skift til M-mode og placere M-mode-aksen på det midt-niveau af den venstre ventrikel. Anskaf og gemme billeder til senere undersøgelser af hjertefunktionen vægtykkelse, kammer dimension, og fraktioneret afkortning (figur 4). Brug af "cardiac pakke", skal du vælge parametre i SAX (kort akse), herunder IVS eller LVAW, LVID, og LVPW, og klik på billedet tegne tilsvarende linjer for hver parameter for at opnå målingerne.
Bemærk: Målinger opnået her bør korrelere nøje til dem, der opnås i parasternal lange akse visning (figur 5).
5. I det apikale Fire-kammer View, BrugDoppler Imaging at Vurdere systoliske og det diastoliske funktion
- Opnå den apikale fire-kammer for at visualisere både venstre og højre ventrikler med atrierne i bunden af skærmen. I B-mode, fra den korte akse visning, vippe det øverste venstre hjørne af platformen til vinklen musens hoved ned og orientere transduceren mod højre skulder af musen. Det er primært for at opnå en "coronal" syn på hjertet kigger op mod spidsen.
- Visualisere mitralklappen i B-mode, og skift til farve Doppler-tilstand, anbringelse prøvevolumenet (den punkterede cursor boks) ved spidsen af mitralklappen.
- Skift til PW Doppler-tilstand til at vurdere strømningsmønstre tværs mitralklappen. Juster Doppler probe markøren parallel med retningen af mitral blodgennemstrømning. Brug en sonde vinkel mindre end 20 ° for at bestemme den maksimale hastighed (figur 6).
- Gem billederne for senere målinger. Brug "cardiac pakke" og vælg "MV flow. "Klik hver parameter og tegne tilsvarende linjer for at opnå målingerne Ledige målinger omfatter:. Peak E hastighed (tidlig påfyldning med aktiv ventrikel afslapning), toppe En hastighed (sen påfyldning med atrial kontraktion), mitral Iso og sammentrækning gange (IVRT og IVCT henholdsvis), og udstødning tid (ET).
- Beregn myokardie ydeevne indeks (MPI) ved MPI = (IVCT + IVRT) / ET.
6. Post-proceduremæssige Behandling af Animal
- Giv analgesi og / eller sterilt saltvand intraperitonealt til kirurgiske dyr, når det er nødvendigt.
- Så dyret kan komme sig på en varmepude i bugleje. Lad ikke et dyr uden opsyn, indtil det har genvundet tilstrækkelig bevidsthed til at opretholde brystleje. Må ikke returnere et dyr, som har gennemgået proceduren for selskab med andre dyr, indtil fuldt tilbagebetalt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser B-mode billeder af aortabuen visning af muse hjerte underkastes sham (figur 1A) eller TAC kirurgi (figur 1B). Aortabuen, innominate arterie, venstre fælles carotidarterie, og venstre arteria subclavia er vist. Bemærk, at aorta konstriktion er klart synlig i TAC, men ikke simuleret hjerte. Color Doppler billeder fra aorta visning er vist i figur 2A. De bølgeformer af aorta flow over forsnævringen stedet blev erobret af PW Doppler imaging (figur 2B). Vellykket TAC vil føre til et signifikant forøget strømningshastighed nedstrøms indsnævringen stedet (typisk ~ 4 m / sek i TAC-mus). Trykgradient over indsnævringen blev beregnet på grundlag peak flow hastighed, ifølge den modificerede Bernoullis ligning (figur 2C).
Figur 3 (figur 3A) eller TAC hjerte (figur 3B). Den øvre panel viser B-mode billeder af den venstre ventrikel, interventricular septum, og en del af den højre ventrikel fra sham eller TAC mus. Det nedre panel viser M-mode kurver for flere hjertecyklusser fra sham eller TAC mus. Målingerne af hjerte-dimensioner vises, herunder venstre ventrikel forreste vægtykkelse (LVAW), venstre ventrikel indvendig diameter (LVID), venstre ventrikel posterior vægtykkelse (LVPW) i diastole og systole. Bemærk signifikant forøget vægtykkelse i muse hjerte underkastet TAC, sammenlignet med sham kirurgi.
Figur 4 viser billeder af parasternal korte akse visning af sham (figur 4A) eller TAC hjerte (figur 4B). Den øvre del af hvert panel viser M-mode akse (den dotted linje) placeret i midten af den venstre ventrikel. Den nedre del af hvert panel er M-mode sporing med streger, der angiver kardiale dimensioner som beskrevet ovenfor. Som en markør for hypertrofi, ventrikulær og septale væg tykkelse kan bestemmes nøjagtigt. Mus udsat for TAC viste forøget vægtykkelse som vurderet ved LVAWd og LVPWD, ventrikulær dilatation som vurderet ved LVISd og LVISs, nedsat kontraktilitet som vurderet ved LVFS og LVEF og forøget LV masse (figur 5).
Figur 6 viser B-mode apikale fire-kammer visning (figur 6A, B) og PW Doppler billeder af transmitral strømningsmønstre (figur 6C, D). Målinger af peak E og A hastighed, IVCT, IVRT, og ET er vist. E / A-forholdet og MPI beregnes (Figur 6E - I). Et sundt mus hjerte har en E / A-forholdet ≥1 og en MPI værdi ≤0.5. I patologiske tilstande med diastolic eller systolisk hjertedysfunktion, såsom i mus udsat for TAC, en nedsat E / A-forhold og / eller en forøget MPI værdi typisk observeres.
Figur 1. B-mode Billede af aortabuen View of Mouse Heart Udsat for skinkirurgi (A) eller TAC (B). Major aorta grene herunder innominate arterie (IA), venstre almindelige carotidarterie (LCCA), og venstre arteria subclavia (LSA) er vist. Bemærk, at tværgående aorta konstriktion (angivet ved den hvide pil) kan visualiseres i TAC, men ikke simuleret hjerte. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Farve / PW Doppler Imaging af TransveRSE Aorta Blood FOW fra aortabuen View. farve (A) og PW (B) Doppler billeder fra fingeret og TAC hjerter er vist. Peak aorta hastighed opnået fra PW dopplerbilledbehandling anvendes til at beregne trykgradient ifølge den modificerede Bernoulli ligning (C). Disse data bekræfter en vellykket TAC kirurgi med trykgradient på ~ 70 mmHg. * P <0,05 vs. Falsk. Data er udtrykt som gennemsnit ± sem n = 15 for Sham og n = 13 for TAC. T-test blev anvendt til at bestemme statistisk signifikans. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. parasternal Lang Axis (PLAX) Udsigt Mouse Heart Udsat for skinkirurgi (A) eller TAC (B). Klik her for at se en større version af dette tal .
Figur 4. parasternal Short Axis (PSAX) Udsigt Mouse Heart Udsat for skinkirurgi (A) eller TAC (B). M-mode billederne, angiver placeringen af prøvevolumen (stiplede gule linje i det øverste panel) og måling af cardiac dimensioner i diastole og systole (blå linjer i det nederste panel). Stjernerne viser papillarmuskler. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. ekkokardiografisk Vurdering af Cardiac Morfologisk og funktionelle ændringer Efter TAC. M-mode scanning i korte akse synspunkt blev udført som i figur 4. (A) LVAWd, venstre ventrikel forreste væg tykkelse i diastole. (B) LVPWD, venstre ventrikel posterior vægtykkelse i diastole. (C) LVIDd, venstre ventrikel indvendig diameter i diastole. (D) LVIDs, venstre ventrikel indvendig diameter i systole. (E) LVFS, venstre ventrikel fraktioneret afkortning. LVFS (%) = (LVIDd-LVIDs) / LVIDd x100%. (F) LVEF, venstre ventrikel uddrivningsfraktion. LVEF (%) = (LVEDV-LVESV) / LVEDV x100%. LVEDV og LVESV betegne venstre ventrikel ende-diastolisk og ende-systolisk volumen, hhv. LV volumen og uddrivningsfraktion er præcist vurderet af Simpso n metode. LV volumen estimeres ved montering mange diske i ventriklen: Simpson volumen = [område (1) + område (2) + ... + område (n)] x længde. Simpson og længde opnås ved at spore den endokardiale grænse af LV i den lange akse og korte akse visning. (G) LV (venstre ventrikel) masse. LV masse (mg) = 1,05 x [(LVIDd + LVPWD + IVDS) 3 - (LVIDd) 3]. Faktoren 1,05 repræsenterer den specifikke densitet af myokardiet. (H) HR, puls. * P <0,05 vs. Falsk. Antallet af mus analyseret er vist i søjler af hvert panel. Data er udtrykt som gennemsnit ± sem t-test blev anvendt til at bestemme statistisk signifikans. Klik her for at se en større version af dette tal.
p_upload / 54101 / 54101fig6.jpg "/>
Figur 6. Vurdering af Transmitral Blood Flow af Doppler Imaging. (A og B) B-mode apikale fire-kammer billede af fingeret (A) eller TAC (B) hjerte. LV, venstre ventrikel; RV, højre ventrikel; MV, mitralklap; TV, trikuspidalklap; LA, venstre atrium; RA, højre atrium. (C og D) PW-Doppler bølgeform af trans-mitral blodgennemstrømningen i sham (C) eller TAC (D) hjerte. Pågældende målinger er vist. (E) E / A, peak E og A hastighed ratio. (F) IVCT, iso-volumetrisk sammentrækning tid. (G) IVRT, Iso-tid. (H) ET, udstødning tid. (I) MPI, myocardial ydeevne indeks. * P <0,05 vs. Falsk. Antallet af mus analyseret er vist i søjler af hvert panel. Data er udtrykt som middelværdi77; sem t-test blev anvendt til at bestemme statistisk signifikans. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ekkokardiografi har været meget anvendt til at vurdere hjertefunktionen i gnaver modeller af hjertesygdomme 2,6. Sammenlignet med invasive eller terminal metoder såsom tryk-volumen loop måling 11 og ex vivo arbejder hjerte 12, ekkokardiografi giver en kraftfuld, noninvasiv redskab til at vurdere igangværende hjerte-strukturelle og funktionelle ændringer i levende dyr. At opnå pålidelige data, er det vigtigt at opretholde legemstemperatur og puls inden fysiologisk område 13 ved omhyggelig justering af varmepladen, og anæstesi niveau. Alle billeder skal indfanges og analyseret konsekvent henhold til de standardiserede billeddannende procedurer, for at lette sammenligningen mellem mus af forskellige stamme eller genotype.
TAC er almindeligt anvendt til at inducere hjertehypertrofi og hjertesvigt hos mus 1. Noninvasive måling af trykgradient over indsnævringen websted ved Dopplerbilleddannelse udgør en pålidelig bedømmelse af graden af trykoverbelastning i mus. Vellykket TAC producerer typisk en trykgradient ≥40 mmHg. Kun mus udsat for tilsvarende grad af pres overbelastning bør medtages til yderligere analyse, mens mus med en trykgradient for lavt eller for højt bør udelukkes. Efter TAC, forventes mus til at udvikle hjertehypertrofi løbet af 1-2 uger, og hjerte dilatation efter 4 uger, afhængig af graden af trykoverbelastning og den genetiske baggrund af testede mus. Den dynamiske hjerte-remodellering og funktionelle ændringer efter TAC kan opgøres pålideligt vurderet af ekkokardiografisk billeddannelse som beskrevet ovenfor.
I modsætning til sin hyppige brug i mennesker 14, farve / PW Doppler har kun været for nylig tilgængelig i gnaver ultralydsscanning 9. Her også vi beskrev anvendelser af dopplerbilledbehandling ved målingen trykgradient samt systolisk og diastolisk ydeevne. Måleling af mitral og tricuspid blodgennemstrømning retningsbestemmelse og hastighed (dvs.., E / A-forholdet, IVRT, IVCT, ET, og MPI) giver vigtige oplysninger om hjertefunktion. ekkokardiografisk billeddannelse udgør således et vigtigt redskab til at studere hjerte-fysiologi og patofysiologi i små dyr.
Begrænsningen af hjerte ultralydsscanning er relateret til måling variabilitet og reproducerbarhed. For at reducere inter- og intra- operatør variabilitet, er det vigtigt at standardisere, hvordan billeder erhverves og analyseret. Målinger skal udføres fra flere akustiske vinduer og tilstande (B-mode, M-mode, og PW / farve Doppler) og mindst 3 separate målinger bør gennemsnit for at sikre nøjagtighed og pålidelighed. Desuden er der begrænsede akustiske vinduer og undertiden lave kvalitet billeder opnås i små gnavere udsættes for kirurgiske procedurer, såsom TAC, på grund af væv hævelse, kirurgiske ar, og lungeødem, som interfererer med ultralydbjælker. For dopplerbilledbehandling, nogle gange er det en udfordring at adskille E og A bølger og få en komplet bølgeform af mitral flow, på grund af en relativ høj puls i små gnavere, især i mus udsat for TAC eller MI kirurgi. Sænkning af puls kan være nyttigt at få målinger, men dette vil påvirke værdier opnået ved dopplerbilledbehandling og dermed datafortolkningsrapporten.
Med de seneste tekniske fremskridt, nyligt udgivet ultralyd systemer giver høj billedopløsning og ramme / samplingfrekvenser at sikre nøjagtig kvantitativ måling i små dyr. Nye ekkokardiografi teknologier vil også forbedre følsomheden af ekkokardiografisk vurdering af hjertefunktionen og tillade tidlig påvisning af hjerte-patologi. For eksempel har speckle-tracking stamme billeddannelse 15 blevet anvendt til præcist at måle regional myocardial funktion. Nye transducer teknologier under udvikling vil give muligheder for real-time, 3D eller 4Dbilleddannelse. Kontrast ekkokardiografi, der er i avanceret udvikling vil give mulighed for volumetriske målinger, vævsperfusion vurderinger, molekylær billeddannelse af cardiovaskulær sygdom og levering af terapeutiske midler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anesthesia equipment | Harvard Apparatus, 84 October Hill Road Holliston, MA |
723015 | |
| Vevo 2100 Imaging System | VisualSonics Inc., 3080 Yonge Street Suite 6100, Box 66, Toronto, Ontario, Canada | Vevo 2100 | |
| Aquasonic ultrasound gel | Parker Laboratories, 286 Eldridge Rd, Fairfield, NJ | 03-50 | |
| Isoflurane | Piramal Healthcare, Inc, 3950 Schelden Circle Bethlehem, PA |
NDC 66794-017-25 | |
| F/air anesthesia gas filter unit | A.M. Bickford, Inc, 12318 Big Tree Rd, Wales Center, NY | 80120 |
References
- Rockman, H. A., et al. Segregation of atrial-specific and inducible expression of an atrial natriuretic factor transgene in an in vivo murine model of cardiac hypertrophy. Proc Natl Acad Sci USA. 88 (18), 8277-8281 (1991).
- Tanaka, N., et al. Transthoracic echocardiography in models of cardiac disease in the mouse. Circulation. 94 (5), 1109-1117 (1996).
- Patten, R. D., Hall-Porter, M. R. Small animal models of heart failure: development of novel therapies, past and present. Circ Heart Fail. 2 (2), 138-144 (2009).
- Heineke, J., Molkentin, J. D. Regulation of cardiac hypertrophy by intracellular signalling pathways. Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (8), 589-600 (2006).
- Oka, T., et al. Cardiac-specific deletion of Gata4 reveals its requirement for hypertrophy, compensation, and myocyte viability. Circ Res. 98 (6), 837-845 (2006).
- Gardin, J. M., Siri, F. M., Kitsis, R. N., Edwards, J. G., Leinwand, L. A. Echocardiographic assessment of left ventricular mass and systolic function in mice. Circ Res. 76 (5), 907-914 (1995).
- Respress, J. L., Wehrens, X. H.
- Pistner, A., Belmonte, S., Coulthard, T., Blaxall, B. Murine echocardiography and ultrasound imaging. J Vis Exp. (42), e2100 (2010).
- Patten, R. D., Aronovitz, M. J., Bridgman, P., Pandian, N. G. Use of pulse wave and color flow Doppler echocardiography in mouse models of human disease. J Am Soc Echocardiogr. 15 (7), 708-714 (2002).
- deAlmeida, A. C., van Oort, R. J., Wehrens, X. H.
- Pacher, P., Nagayama, T., Mukhopadhyay, P., Bátkai, S., Kass, D. A. Measurement of cardiac function using pressure-volume conductance catheter technique in mice and rats. Nat Protoc. 3 (9), 1422-1434 (2008).
- Larsen, T. S., et al. The isolated working mouse heart: methodological considerations. Pflugers Arch. 437 (6), 979-985 (1999).
- Roth, D. M., Swaney, J. S., Dalton, N. D., Gilpin, E. A., Ross, J. Jr Impact of anesthesia on cardiac function during echocardiography in mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 282 (6), H2134-H2140 (2002).
- Pearlman, A. S., Stevenson, J. G., Baker, D. W. Doppler echocardiography: applications, limitations and future directions. Am J Cardiol. 46 (7), 1256-1262 (1980).
- Bauer, M., et al. Echocardiographic speckle-tracking based strain imaging for rapid cardiovascular phenotyping in mice. Circ Res. 108 (8), 908-916 (2011).
