셀룰로오스 종이 디스크와 벌거 벗은 눈 색채 면역 측정법에 그들의 응용 프로그램에 항체의 결합 공유
Summary
In this manuscript, periodate oxidation and glutaraldehyde cross-linking methods for covalent immobilization of antibodies on paper discs are presented. The binding activity of immobilized antibodies was evaluated. Based on these results, a glutaraldehyde cross-linking method was used to develop a novel paper-based immunoassay for immunoglobulin G (IgG) detection.
Abstract
이 보고서는 셀룰로오스 필터 종이 학년 1 위 (중간 흐름 여과지) 디스크 및 등급 번호 113 (빠른 흐름 여과지) 디스크에 캡처 항체의 공유 고정하는 두 가지 방법을 제시한다. 항체 그들에 고정되기 전에 이러한 셀룰로오스 종이 디스크는 실란 커플 링 기술을 통해 아민 작용기로 그래프트 하였다. 요오드 산 산화 및 글루 타르 알데히드 가교 방법은 셀룰로오스 종이 디스크에 포획 항체를 이식하는데 사용되었다. 고정화 후 목표물을 포획 항체의 최대 결합능을 보장하기 위해, 요오드 산 나트륨, 글루 타르 알데히드, 용지 디스크의 표면 상에 포획 항체의 다양한 농도의 영향을 조사 하였다. 요오 산화법에 비해 글루 타르 알데히드 가교제 통해 아민 – 작용 화 셀룰로스 페이퍼 디스크에 코팅 된 항체는 표적에 결합 활성을 강화 보였다. (마우스 혈청 참조)의 IgG는 글루 타르 알데히드를 통해 공유 적으로 고정화 된 항체의 애플리케이션을 테스트하기 위해이 연구를 기준 타겟으로서 사용 하였다. 새로운 종이 기반, 효소 면역 분석법 (ELISA)이 성공적으로 개발 및 IgG를 검출하기위한 검증 하였다. 이 방법은 장비를 필요로하지 않으며, IgG를 100 NG / ㎖를 검출 할 수있다. 고속 유동 여과지 매체 흐름 여과지보다 더 민감했다. 이 분석의 배양 기간은 짧았다 작은 샘플 볼륨이 필요합니다. 이 맨눈으로는 색채 면역 종래 ELISA로 식별되는 다른 대상을 검출하도록 확장 될 수있다.
Introduction
점의 케어 테스트 (POCT) 진단 연구는 치료제에 대한 새로운 전략의 개발, 맞춤 의학 및 홈 케어 1 중요합니다. 그들은 싼 접근, 사용자 2에 익숙한로 셀룰로오스 종이 널리 면역에서 플랫폼으로 사용됩니다. 또한 셀룰로스 종이의 다공성 구조는 추가적인 에너지에 영향을주지 않고, 액체 흐름을 유발할 수있는 능력을 가지고있다. 종이 기반 bioanalysis의 기록은 초기에 가장 널리 퍼진 예는 임신과 당뇨병 테스트 스트립과 같은 면역 크로마토 그래피 테스트 3, 1952 종이 크로마토 그래피에 처음 발명 된 20 세기, 같은 찾을 수 있습니다. 이 테스트는 상대적으로 빠른 분석 시간과 저렴한 분석 (4)를 제공합니다. 그들의 단순에, 이러한 종래의 종이 스트립 시험은 널리 POCT 진단 (5)에 사용되어왔다.
비색 6 전기 포함 검출 방법화학 (7) 및 (8) 전기 화학 발광 방법은 생물학적 샘플에서 표적을 측정하기 위해보고되었다. 이러한 양적 방법 이외에, 셀룰로오스 종이에 항체를 고정화하기위한 신뢰할 수있는 방법은 진단 장치의 개발이 중요하다. 비특이적 흡착 고정화 후 목표물을 최대 결합능을 보장하기 위해 종이 기반의 장치 (9), (10)의 표면 상에 항체를 수정하기위한 주요 전략이다. 그러나, 이전의 연구 셀룰로오스 종이에 흡착되는 항체가 40 %, 섬유 (11)로부터 탈착 될 수있는 것으로 나타났다. 따라서, 셀룰로오스 상에 항체의 직접 흡착 재현 가능한 결과 (12)를 제공하지 않을 수 있습니다. 종이 표면에 그라프 트되어 항체의 공유 고정화 효과 지필 생물 검정 (13)를 개발하는 다른 방법이다. 다양한 방법이 셀룰로오스 (14) (15)의 변형에 대해보고 된 </sup>. 이상적으로, 항체 고정화 (12) 후 원래의 기능을 유지해야한다. 카르 1- 시아 노 -4- 플루오로 보레이트 dimethylaminopyridinium 16과 결합; 18 UV 계 활성화 전략 17 내지 1- 플루오로 -2- 나이트로 -4- azidobenzene; 크 실로 글루칸 변성 (19)에 기초한 화학 효소 적 전략; 1,4- phenylenediisothiocyanate 링킹 에이전트 (20); 헤테로 다당류 산화 (21) 클릭 화학 (22) 양이온 포르피린 23은 공유 셀룰로오스 종이에 생체 분자를 고정하기 위해 사용되어왔다. 키토산 수정 용지가 풍부하고 27 생체 적합성 때문에 종이 기반 immunodevices 24-26을 개발하는 데 사용되었습니다. 키토산은 양이온과 음이온 셀룰로오스 (27)에 강력하게 준수합니다. 캡처 항체는 키토산 코팅 및 글루 타르 알데히드 가교를 통해 종이에 고정된다. 요오드 산화는 대위를 접목하는 또 다른 방법이다셀룰로오스 종이 (28)에 URE 항체. 이 방법에서, 소듐 페리오 데이트는 알데히드기 직접 셀룰로오스 1,2- 디 히드 록시 (글리콜) 그룹을 변환하는 종이 발견된다. 알데히드 그룹은 다당류 및 항체 (28) 사이에 공유 결합을 형성하기 위해 사용된다. 제조가 간단하지만, 완전히 요오드 산 나트륨을 세척하는 것은 어렵다. 미세 정 요오드 산 나트륨은 항체의 활성 및 안정성에 영향을 셀룰로오스 종이에 고정화 된 항체의 추가적인 산화를 일으킬 수 N을 -. (3- 디메틸 아미노 프로필) – N 다이이 미드 하이드로 클로라이드 및 N -hydroxysuccinimide 크로스 링커들도 사용되어 공유 나노 기반 분석 (29)의 발전을위한 전기 방사 폴리 L 락트산과 셀룰로오스 아세테이트 나노 파이버에 항체를 고정시킨다.
이 연구에서, 실란 커플 링 기술은 cellulos에 아민 작용기를 접목하는 데 사용전자 종이 디스크. 이 기술은 최대 세로 관류의 면역 있도록 원래의 기공 크기, 위킹 및 셀룰로스 여과지 여과 속도를 유지하도록 돕는다. 실란 커플 링 기술은 널리 다른 변형하여 생체이어서, 2 급 아민기를 갖는 기판의 표면을 기능화하는 바이오 센서에 사용되어왔다. 매트릭스 표면에 아민 기의 그 래프팅은 -OH 능성 실란 에이전트 그룹 및 매트릭스 기판 (30) 사이의 축합 반응을 포함한다. 셀룰로오스 종이 디스크 3- 아미노 프로필 트리 메 톡시 실란 (APS) 31 실란 커플 링에 의해 아민기로 작용 화 하였다. 이것은 두 가지 방법을 사용하여 공유 고정화 캡처 항체으로 이어졌습니다. 첫 번째 방법은 아민 관능 화 셀룰로스 페이퍼 디스크에 요오드 산화 캡쳐 항체의 결합을 포함했다. 두 번째 방법은 캡처 antibodi를 연결하는 가교 결합제로서 글루 타르 알데하이드를 사용아민 그룹 기능화 셀룰로오스 종이 디스크에 말이지. 포획 항체의 존재는, 형광 분자, 이미 저를 사용하여, 토끼 항 – 인간 IgG-형광 염료 (FITC)에 의해 확인 하였다. 항 – 토끼 IgG의 염소를 위해 토끼 항 – 인간 IgG-FITC의 결합 활성은 퍼 옥시 다제 기질로 평가 하였다. 과 요오드 산 나트륨, 글루 타르 알데히드 및 포획 항체의 다양한 농도의 효과를 조사 하였다. 고정화 된 포획 항체의 애플리케이션 테스트가 성공적 IgG의 혈청의 검출을 수행 하였다.
Protocol
Representative Results
Discussion
변성 셀룰로오스 종이 디스크의 친 화성 정제 된 염소 항 – 마우스 IgG-FC 캡쳐 항체의 직접적인 코팅은 IgG의 농도를 검출 하였다. 결과는 포획 항체의 추가 고정은 재현성이 요구되는 것으로 나타났다. 실란 기술이 성공적 셀룰로오스 종이 디스크 (34)에 아민 작용기를 도입하는 데 사용 하였다. APS의 농도는 항체의 고정화에 영향을 미친다. 따라서, 아세톤 APS의 양도 최적화 하였다. 아세톤 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was financially supported by the Ministry of Education, Singapore through the Translational and Innovation Grant (MOE2012-TIF-2-G-009).
Materials
| Cellulose filter paper, Grade1 (medium flow filter paper) | GE Healthcare Pte Ltd Singapore | 1001 110 | |
| Cellulose filter paper, Grade113 (Fast flow filter paper) | Sigma-Aldrich, Singapore | 1113-320 | |
| 3-Aminopropyltrimethoxysilane | Sigma-Aldrich, Singapore | T1255 | >96% |
| Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich, Singapore | G6257 | Grade II, 25% in H2O |
| Surfactant | Tween-20, Sigma-Aldrich, Singapore | P2287 | |
| Bovine serum album | Sigma-Aldrich, Singapore | A2153 | |
| Skimmed milk powder | Louis François | Packed by Kitchen Capers, Singapore | |
| Tris base | Promega | H5135 | |
| Sodium periodate | Merck | 106597 | |
| Na2HPO4 | Merck | 106585 | |
| KH2PO4 | Merck | 104873 | |
| NaCl | CALBIOCHEM | 567441 | |
| NaOH | Merck | 106462 | |
| HCL | Merck | 100317 | |
| phosphate buffer saline (PBS) | N/A | N/A | PBS, containing 137 mmol/L NaCl, 2.7 mmol/L KCl, 8.0 mmol/L Na2HPO4 and 1.5 mmol/L KH2PO4, is prepared with water and adjusted to pH 7.4 with 0.1 mol/L NaOH or 0.1 mol/L HCl |
| Acetone | Tee Hai Chem Pte Ltd Singapore | 9005-68 | |
| Mixture of TMB and hydrogen peroxide solution | 1-Step ultra TMB-ELISA solution , Thermo Scientific Pierce | 34029 | 1 L |
| Rabbit anti-human IgG-FITC | TWC/Bio Pte Ltd Singapore | sc-2278 | |
| Peroxidase conjugated goat anti-rabbit IgG | TWC/Bio Pte Ltd Singapore | sc-2030 | |
| Affinity purified goat anti-Mouse IgG-Fc coating antibody | Bethyl Laboratories, Inc | A90-131A | |
| Mouse reference serum | Bethyl Laboratories, Inc | RS10-101-5 | 9.5 mg/mL |
| HRP conjugated goat anti-mouse IgG-Fc detection antibody | Bethyl Laboratories, Inc | A90-131P | |
| Equipment | |||
| Fourier transform infrared spectrophotometer | Shimadzu IR Prestige-21 | N/A | |
| Fluorescence molecular imager | Pharos FXTM plus molecular imager, Bio-Rad, Singapore | N/A | |
| Oven | NUVE FN500 | N/A | |
| Turbo mixer VM-2000 | MYC LTD | N/A | |
| Image J | RGB, free download | N/A | |
References
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