Denne artikkelen beskriver high-throughput analysen som er opprettet for å screene store biblioteker av små molekyler for deres potensielle evne til å manipulere cellulære nivåer av syklisk di-GMP i Pseudomonas aeruginosa, som gir en ny kraftig verktøy for antibakterielle medisiner og sammensatte testing.
Bakteriell resistens mot tradisjonelle antibiotika har drevet forskning forsøk på å identifisere nye narkotika mål i nylig oppdagede regulatoriske veier. Regulatoriske systemer som benytter intracellulær cyklisk di-GMP (c-di-GMP) som en andre budbringer er en slik klasse av målet. c-di-GMP er et signalmolekyl som finnes i nesten alle bakterier som fungerer for å regulere et omfattende utvalg av prosesser inkludert antibiotikaresistens, biofilmdannelse og virulens. Forståelsen av hvordan c-di-GMP signale kontroller aspekter av antibiotikaresistent biofilm utvikling har foreslått tilnærminger der endring av mobiltelefon konsentrasjoner av nukleotid eller avbrudd av disse signalveier kan føre til redusert biofilmdannelse eller økt mottakelighet av biofilm til antibiotika. Vi beskriver en enkel high-throughput bioreporter protokollen, basert på grønt fluorescerende protein (GFP), hvis ekspresjon er under kontroll av c-di-GMP-responsive promoter CDRA, For raskt å screene for små molekyler med potensial for å modulere c-di-GMP cellulære nivåer i Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). Denne enkle protokollen kan skjermen oppover på 3,500 forbindelsene i løpet av 48 timer, og har evnen til å bli tilpasset til mange mikroorganismer.
Den raske utviklingen av resistens mot klinisk viktige antibiotika er en av de store bekymringene nå står overfor helsepersonell over hele verden. Dette svikt i tradisjonelle antibiotika har drevet nye søk for kjemisk sak som kan forstyrre bakterie prosesser involvert i virulens og sykdomsprogresjon en. Et slikt reguleringssystem som benytter den intracellulære andre messenger syklisk di-GMP (c-di-GMP) har nylig blitt et mål med lovende gyldighet 2-4. Det er fastslått at denne globale andre messenger signalmolekyl regulerer mange funksjoner, inkludert antibiotikaresistens, vedheft, biofilmdannelse og sykdom 2-4.
Det er nå klart at den cellulære nivået av c-di-GMP i bakteriecellen blir styrt av syntese og nedbrytning hvorved to molekyler av GTP blir brukt til å syntetisere c-di-GMP ved GGDEF domene-inneholdende diguanylate cyclases (DGCs) whereas c-di-GMP Nedbrytningen katalyseres av fosfodiesterase (PDE) som enten har en EAL eller en HD-GYP domene (anmeldt i (3, 5)). Proteiner som inneholder disse domenene inneholder ofte andre signal domener, noe som tyder på at deres aktivitet i c-di-GMP omsetning er regulert enten direkte eller indirekte av miljømessige eller mobil 3,5 signaler. Derfor c-di-GMP signale funksjoner for å knytte sensing av ulike miljø signaler om endringer i bakterie fenotype. c-di-GMP utøver sin regulerende effekt på bakterier på nivået av transkripsjon, post-transkripsjon og post-oversettelse av ulike mekanismer 4.
En stor innflytelse av c-di-GMP i mange bakterieceller er i bestemmelse av bakteriell "livsstil" og, i særdeleshet, i kontrollen av overganger mellom bevegelige planktoniske celler og fastsittende celler festet til overflater eller organisert i de flercellede strukturer av biofilmer 3,5. Generelt, høy cellulærnivåer av c-di-GMP er forbundet med biofilmdannelse og sessility, mens lave cellulære nivåer stimulere motiliteten og virulens faktor syntese i mange bakterielle patogener 3,5. Således kan et mer detaljert kjennskap til driften av c-di-GMP-signalering gi strategier for inhibering av biofilmdannelse og virulens i bakterielle patogener. Dette er en krevende oppgave gitt at de fleste bakterielle genomer kode mange proteiner med GGDEF, EAL og / eller HD-Gyp domener (for eksempel P. aeruginosa har over 40 proteiner) og flere effektorer 6,7.
Men selv med denne kompleksiteten, tyder nyere bevis for at strategiene manipulere c-di-GMP signale kan utvikles til enten å hindre antibiotikaresistente infeksjoner utvikle eller gjøre dem utsatt for immunsystemet eller effektiv behandling av samtidig bruk av klassiske antibiotika 2. I tråd med dette har det vist eksperimentelt at kunstig nedgangav intracellulær c-di-GMP in in vitro -grown P. aeruginosa fører til redusert biofilmdannelse og økt mottakelighet for antimikrobielle midler, mens P. aeruginosa -developed biofilmer på silikonimplantater, som befinner seg i bukhulen til mus, kan dispergeres på en lignende måte 8-11.
Her beskriver vi en høy gjennomstrømming, fluorescens-basert reporter analysen for å skjerme små molekyler som potensielt kan modulerer cellulære c-di-GMP nivåer i P. aeruginosa (figur 1). Analysen er basert på måling av c-di-GMP cellulære nivåer ved hjelp av en tidligere utviklet GFP rapportør hvis ekspresjon er transkripsjonelt bundet til c-di-GMP-responsive CDRA promoter 12. Denne protokollen beskriver metodologi for ekspresjon av reporter konstruksjonen i P. aeruginosa stamme av interesse, sammensatt plate forberedelse, kultur inokulasjon i 384-brønners plater, vekstvilkår, som vill som detaljer om datainnsamling, ledelse og analyse (figur 1). Samlet denne protokollen vil hjelpe forskere å potensielt identifisere nye forbindelser rettet mot c-di-GMP signalering i bakterier, og til bruk i forskning med sikte på å forstå biologien til P. aeruginosa.
For å forbedre behandlingen av bakterieinfeksjoner, er det klart at en bedre forståelse av bakteriell oppførsel på molekylært reguleringsnivå er nødvendig. Prosedyren er beskrevet her vil være gunstig for mikrobiologer, biokjemikere og klinikere som ønsker å avdekke små molekyler som har potensial til å manipulere eller forstyrre cellulære konsentrasjoner av c-di-GMP i bakterier. Fremgangsmåten benytter et nylig utviklet GFP bioreporter å overvåke cellulære nivåer av c-di-GMP i P. aeruginosa 12. Dette bioreporter har blitt validert og vist viktig ikke å påvirke veksten av stammen som brukes når dyrket i 5% LB i PBS. Bruken av en hel-celle-skjermen for å identifisere små molekyler som endrer c-di-GMP-nivåer in vivo overvinner de største vanskelighetene med target-baserte stoffet funnet i form av molekylet gjennomtrengning gjennom de bakterielle membraner, særlig gjennom de av Gram-negative bakterier . Viktigere, tHan analysen vises veldig robust som en robust z 'verdi konsekvent over 0,5 ble observert i alle skjermene til dags dato. Screening ved anvendelse av denne protokollen vil avdekke et antall av små molekyler som hemmer og / eller fremmer intracellulære c-di-GMP-nivåer i P. aeruginosa. Videre har denne analysen også har potensial til å identifisere baktericide eller bakteriostatiske forbindelser som resulterer i en reduksjon i OD600 utlesning.
Selv om det ikke er omtalt i protokollen delen, er det flere viktige betraktninger for fremstilling av forsøket. Det er viktig å huske på at GFP bioreporter er basert på et plasmid. Selv om reporter plasmid er kjent for å være meget stabil i P. aeruginosa, kan det være tapt etter kontinuerlig re-plating, derav behovet for å bruke ferske belagt stammer fra en -80 ° C glyserol lager, og sjekke fluorescens uttrykk er avgjørende. Det er også meget verdifull for å opprettholde ensartede vekstbetingelser i hele skjermensiden eventuelle svingninger i disse forholdene kan ha ringvirkninger på skjermen. Dette vil inkludere gjør sikkert at media og antibiotika er forhåndslagde i batch og brukes i løpet av skjermen. Bakteriekulturer ikke vokser (basert på OD 600 leser-outs) på en ensartet måte er et vanlig problem for de fleste high-throughput skjermer av denne art. Dette kan være på grunn av kanteffekter eller tappe en ikke-homogen bakteriekultur inn i platene. For den tidligere, noe som gjør at en gass-gjennomtrengelig pakning brukes under inkubasjon er avgjørende. Mens for de sistnevnte, grunning væskebehandler røret med et volum av kulturen minst tre ganger dødvolumet av røret i seg selv er anbefalt. Det er viktig å holde magnetrører ved minimal hastighet under utlevering. Mens overvåking og lagring av de 384-brønns plater for jevn vekst i løpet av forsøkene er av vesentlig betydning, en situasjon for å unngå er stabling av platene i løpet av inkuberingen som det kan føre unønsket oksygen gradienter som fører til en skjevhet i vekstmønster. Det er også viktig å sikre at kjøretøyet DMSO anvendt som en negativ kontroll ikke blir negativt påvirket vekst av stammen av interesse. Mange av disse problemene forbundet med vekst kan unngås ved å utføre en uekte skjerm med bakteriestammen av interesse før screening. Tolking også fordeler det hensyn at c-di-GMP-inhiberende Resultatene beregnes ved endringen i vilkårlige fluorescens intensitet heter som må korrigeres for endringen i celletetthet. Med dette i tankene forskjellige matematiske formler for å vurdere datautgang fra disse eksperimentene bør også tas i betraktning. For eksempel kan en forbindelse vises som en c-di-GMP-inhibitor, men faktisk være en vekstinhibitor eller vice versa, noe som krever forsiktig tolkning av identifiserte treff.
Det er flere ulemper og begrensninger som må vurderes under utviklingen og utførelsen av dennehigh-throughput celle-basert skjerm. For eksempel er de bio-rapportør funksjoner på et indirekte mål på cellulære c-di-GMP-nivåer ved hjelp av en fluorescerende probe som deteksjonsegenskapene kan potensielt bli påvirket av små molekyler som brukes i en skjerm. En tangentiell problemet er det faktum at det cellebaserte analysen gir ingen informasjon om mekanismen bak endringer i nivåene av intracellulær c-di-GMP. Derfor må viktige observasjoner fra forsøk bekreftes ved hjelp av en væskekromatografi-massespektrometri tilnærming, som regnes som den "gullstandarden" metode for å måle intracellulære c-di-GMP svingninger i bakterier. Videre kan vår fremgangsmåte bare gi informasjon angående virkemåten av bakterier som var dyrket in vitro, som bakterieceller dyrket i sammenheng med verten (in vivo) raskt endre sine aktiviteter på grunn av dette miljøet. Videre er prosessen med å bruke en GFP bioreporter innebærer at skjermen ikke tari betraktning den fysiologiske statusen til bakterieceller. Imidlertid kan protokollen tilpasses mikroskopisk kontroll av individuelle brønner i løpet av skjermen.
Selv med disse betraktninger og begrensninger, er dette high-throughput-analysen likevel en robust skjerm for små molekyler som er i stand til å interferere med intracellulære c-di-GMP-nivåer. Siden mange mikrobielle arter, inkludert mange bakterielle patogener har blitt studert for å karakterisere modulering av intracellulær c-di-GMP-nivåer, kan vår protokoll anvendes på forskjellige bakteriearter og utvidet til studiet av mer kompliserte flerbestands bakterier modeller. Analysen kan lett optimaliseres for andre bakterielle arter ved å forandre vekstbetingelsene som brukes, eller kan være innrettet til å lese andre utganger ved hjelp av ulike bioreporters. Forskjellige inkubasjonstider kan brukes, avhengig av vekstfasen av interesse. Men når du skalerer opp eller øke gjennom-put, er det importan t å huske på at bakterier vil fortsatt være økende i løpet av plate forberedelser og avlesnings målinger. Derfor anbefales det å skjerme maksimalt 15 plater på en gang ved hjelp av denne protokollen. Dessuten, ved bruk av plater med mer enn 384 brønner er det ikke mulig ensartet vekst, noe som krever ytterligere optimalisering. Når skalere ned antall plater, kan det være mer hensiktsmessig å inokulere manuelt ved hjelp av en elektronisk pipette i stedet for en væskehåndteringsrobot. Det er klart at denne protokollen kan bli brukt til å undersøke små molekyler som sprer biofilmer, gitt at anti-biofilm-forbindelser forstyrre c-di-GMP-signalering. Protokollen kan også bli bygget ut til å forstå ulike aspekter av bakteriell fysiologi. Gitt at c-di-GMP signalering er utbredt i de fleste bakterier, ved å studere physiologies av disse organismene bruker denne protokollen kan vi identifisere ulike kjemiske stimuli for å avgjøre hvorvidt arbeids mekanismer krever c-di-GMP signalering.
_content "> I sammendraget, vil robusthet og allsidighet av tilnærmingen presenteres i denne protokollen hjelpe identifisering av kjemiske midler med c-di-GMP signalering i mange biologiske systemer.The authors have nothing to disclose.
We thank the Tolker-Nielsen lab for their generous donation of reporter constructs used to develop the screen. We also thank members of the Ryan laboratory for their helpful comments and critical reading of the manuscript. The work of the authors has been supported in part by grants awarded by the Wellcome Trust (WT100204AIA senior fellowship grant to R.P.R. and 093714/Z/10/Z PhD scholarship to K.N.R.).
Lysogeny Broth (Lennox) | Sigma Aldrich | L3022-1KG |
Sucrose | Sigma Aldrich | S0389-1KG |
Lysogeny Broth with Agar (Lennox) | Sigma Aldrich | L2897-1KG |
Ampicillin sodium | Sigma Aldrich | A0166-25G |
Glycerol | Sigma Aldrich | G5516-1L |
Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 | Life technologies | 10010-056 |
Tobramycin sulfate | Sigma Aldrich | T1783-100MG |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | 276855-250ML |
Genesys 10S UV-Vis spectrophotometer | Thermoscientific | 840-208100 |
2 mm gap electroporator cuvette | Bio-Rad | 1652092 |
BioRad GenePulser XCell electroporator | Bio-Rad | 1652662 |
Leica Fluorescent Stereomicroscope | Leica Microsystems | MZ16FA |
BRAND magnetic stirring bar, PTFE, cylindrical with pivot ring (sterilise by autoclaving before use) | Sigma Aldrich | Z328952-10EA |
384-well, white-walled, clear-bottom plates | Greiner | 781098 |
Multidrop Combi reagent dispenser | Thermo Scientific | 5840300 |
Multidrop Combi tubing | Thermo Scientific | 24073290 |
VIAFLO II 16-channel electronic pipette | Integra Biosciences | 4642 |
100 mL sterile disposable reagent reservoirs | Fisher Scientific | 12399175 |
AeraSeal air-permeable membranes | Sigma Aldrich | MKBQ1886 |
Pherastar plate reader (Software version: 4.00 R4, Firmware version: 1.13) | BMG Labtech | Pherastar FS |