Den här artikeln beskriver hög genomströmning analys som har upprättats för att screena stora bibliotek av små molekyler för deras potentiella förmåga att manipulera cellulära nivåerna av cykliskt di-GMP i Pseudomonas aeruginosa, vilket ger en ny kraftfullt verktyg för antibakteriella läkemedelsutveckling och förening testning.
Bakteriell resistens mot traditionella antibiotika har drivit forsknings försök att identifiera nya läkemedelsmål i nyligen upptäckt regulatoriska vägar. Regulatoriska system som utnyttjar intracellulär cyklisk di-GMP (c-di-GMP) som en andra budbärare är ett sådan klass av målet. c-di-GMP är en signalmolekyl som finns i nästan alla bakterier som verkar för att reglera ett brett spektrum av processer, inklusive antibiotikaresistens, biofilm formation och virulens. Förståelsen för hur C-di-GMP signalering kontroller aspekter av antibiotikaresistenta biofilm utveckling har föreslagit metoder där ändring av cellulära koncentrationer av nukleotid eller avbrott i dessa signaleringsvägar kan leda till minskad biofilmbildning eller ökad känslighet av biofilmer till antibiotika. Vi beskriver en enkel hög genomströmning bioreporter-protokollet, baserat på grönt fluorescerande protein (GFP), vars expression är under kontroll av c-di-GMP responspromotor CDRASnabbt att screena för små molekyler med potential att modulera c-di-GMP cellulära nivåer i Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). Denna enkla protokoll kan skärmen uppemot 3.500 föreningar inom 48 timmar och har förmågan att anpassas till flera mikroorganismer.
Den snabba utvecklingen av bakterieresistens mot kliniskt viktiga antibiotika är en av de viktigaste frågorna för närvarande står inför vårdpersonal över hela världen. Detta misslyckande av traditionella antibiotika har kört nya sökningar för kemisk materia som kan störa bakterie processer i virulens och sjukdomsprogression en. Ett sådant regleringssystem som utnyttjar den intracellulära andra budbärare cyklisk di-GMP (c-di-GMP) har nyligen blivit ett mål med lovande giltighet 2-4. Det har fastställts att detta globala andra budbärare signalmolekyl styr många funktioner, inklusive antibiotikaresistens, vidhäftning, biofilm formation och sjukdom 2-4.
Det är nu underförstått att den cellulära nivån av c-di-GMP i den bakteriella cellen styrs av syntes och nedbrytning genom vilka två molekyler av GTP används för att syntetisera c-di-GMP genom GGDEF domäninnehållande diguanylate cyclases (DGCs) whereas c-di-GMP nedbrytning katalyseras av fosfodiesteraser (PDE), som har antingen en EAL eller en HD-GYP domän (översikt i (3, 5)). Proteiner som innehåller dessa domäner innehåller ofta andra signal domäner, vilket tyder på att deras verksamhet i c-di-GMP omsättningen regleras antingen direkt eller indirekt av miljö- eller cellulära 3,5 ledtrådar. Följaktligen c-di-GMP signalering funktioner för att koppla avkänning av olika miljö ledtrådar till ändringar i bakterie fenotyp. c-di-GMP utövar sin reglerande effekt i bakterier vid nivån för transkription, post-transkription och post-translation genom olika mekanismer 4.
En stor påverkan av c-di-GMP i många bakterieceller är vid fastställandet av bakteriell "livsstil", och i synnerhet i kontrollen av övergångarna mellan rörliga planktonceller och fastsittande celler fästa till ytor eller organiserade i flercelliga strukturer av biofilmer 3,5. I allmänhet hög cellulärnivåer av c-di-GMP är förknippade med biofilm formation och sessility, medan låga cellulära nivåer uppmuntra rörlighet och virulensfaktor syntes i många bakteriella patogener 3,5. Således, en mer detaljerad kunskap om arbetet i c-di-GMP signalering hade råd strategier för inhibering av biofilmbildning och virulens i bakteriella patogener. Detta är en svår uppgift med tanke på att de flesta bakteriella genomen kodar många proteiner med GGDEF, EAL och / eller HD-GYP domäner (t ex P. aeruginosa har över 40 proteiner) och flera effektenheter 6,7.
Men även med denna komplexitet, föreslår nya bevis att strategier manipulera c-di-GMP-signalering kan utvecklas antingen förhindra antibiotikaresistenta infektioner utveckla eller göra dem mottagliga för immunsystemet eller effektiv behandling av samtidig administrering av klassiska antibiotika 2. I linje med detta har det experimentellt visat att konstgjord minskningav intracellulär c-di-GMP i in vitro- -grown P. aeruginosa leder till minskad biofilmbildning och ökad känslighet för antimikrobiella medel, medan P. aeruginosa -developed biofilmer på silikonimplantat, som ligger i den peritoneala kaviteten hos möss, kan dispergeras på ett liknande sätt 11/08.
Här beskriver vi en hög genomströmning, fluorescensbaserad reporteranalys för att screena små molekyler som potentiellt kan modulera de cellulära c-di-GMP-nivåer i P. aeruginosa (Figur 1). Analysen är baserad på mätning c-di-GMP cellulära nivåer med hjälp av en tidigare utvecklad GFP reporter vars expression är transkriptionellt kopplad till c-di-GMP-responsiva CDRA promotorn 12. Detta protokoll beskriver metodologin för uttryck av reporterkonstruktion i P. aeruginosa stam av intresse, förening tallrik förberedelse, kultur ympning i 384-brunnsplattor, tillväxtbetingelser, som vill som uppgifter om insamling, hantering och analys (Figur 1). Sammantaget kommer detta protokoll att hjälpa forskare att potentiellt identifiera nya substanser som c-di-GMP signalering i bakterier, och för användning i forskning som syftar till att förstå biologi P. aeruginosa.
I syfte att förbättra behandlingen av bakteriella infektioner, är det tydligt att en bättre förståelse av bakteriell beteende på molekylär regleringsnivå krävs. Det förfarande som beskrivs här kommer att vara till nytta för mikrobiologer, biokemister och kliniker som vill upptäcka små molekyler som har potential att manipulera eller störa cellulära koncentrationer av c-di-GMP i bakterier. Metoden utnyttjar en nyligen utvecklad GFP bioreporter att övervaka cellulära nivåerna av c-di-GMP i P. aeruginosa 12. Denna bioreporter har godkänts och visat allt inte att påverka tillväxten av stammen används vid odling i 5% LB i PBS. Användningen av en helcells-skärmen för att identifiera små molekyler som förändrar c-di-GMP nivåer in vivo övervinner de stora svårigheterna med mål-baserade läkemedelsupptäckt i termer av molekyl penetration genom de bakteriella membranen, särskilt genom de av gramnegativa bakterier . Viktigare, tHan analys verkar mycket robust som en robust z "värde ligger över 0,5 observerades i alla skärmar hittills. Screening med hjälp av detta protokoll kommer att avslöja ett antal små molekyler som hämmar och / eller främja intracellulära c-di-GMP-nivåer i P. aeruginosa. Dessutom har denna analys också potential att identifiera bakteriedödande eller bakteriostatiska föreningar resulterar i en minskning av OD 600 avläsning.
Även om det inte diskuteras i protokollet avsnitt, finns det flera viktiga överväganden för framställning av experimentet. Det är viktigt att komma ihåg att GFP bioreporter baseras på en plasmid. Även reporterplasmiden är känd för att vara mycket stabil i P. aeruginosa, kan den gå förlorad efter kontinuerlig re-plating, därav behovet av att använda färska pläterade stammar från en -80 ° C glycerol lager och kontroll fluorescens uttryck är kritisk. Det är också mycket värdefullt att behålla enhetliga tillväxtbetingelser hela skärmeneftersom eventuella förändringar i dessa förhållanden kan ha en dominoeffekt på skärmen. Detta skulle inkludera att göra vissa att media och antibiotika är färdiga i parti och används under hela skärmen. Bakteriekulturer inte växer (baserad på OD 600 avläsningar) på ett enhetligt sätt är ett vanligt problem för de flesta med hög kapacitet för skärmar av detta slag. Detta kan vara på grund av kanteffekter eller dispensera en icke-homogen bakteriekultur in i plattorna. För de förstnämnda, att se till att ett gaspermeabelt tätning används under inkubationstiden är avgörande. Medan för den senare, priming vätskehanteraren rör med en volym av kulturen minst tre gånger dödvolymen av slangen själv rekommenderas. Det är mycket viktigt att hålla den magnetiska omrörare vid minimal hastighet under utportionering. Medan övervakning och lagring av 384-brunnsplattor för en stabil tillväxt under loppet av experimenten är av största vikt, en situation för att undvika är stapling av plattorna under inkubation eftersom det kan orsaka unville syre gradienter leder till en skev i tillväxtmönstret. Det är också viktigt att se till att DMSO-vehikel användes som en negativ kontroll inte att negativt påverka tillväxten av stammen av intresse. Många av dessa frågor är associerade med tillväxt kan undvikas genom att utföra en mock skärm med den bakteriella stammen av intresse före screening. Tolkning av data också förtjänar hänsyn att c-di-GMP inhibitions resultaten beräknas av förändringen i godtyckliga fluorescensintensitetsenheter som måste korrigeras för förändringen i celltätheten. Med detta i åtanke olika matematiska formler för att bedöma utgångsdata från dessa experiment bör också övervägas. Till exempel kan en förening visas som en c-di-GMP-inhibitor men faktiskt vara en tillväxtinhibitor eller vice versa, vilket kräver en försiktig tolkning av identifierade träffar.
Det finns flera nackdelar och begränsningar som måste beaktas under utvecklingen och resultatet av dettahög genomströmning cellbaserad screen. Till exempel, de bio-reporter funktioner på ett indirekt mått på cellulära c-di-GMP nivåer med hjälp av en fluorescerande sond, vars detekteringsegenskaper skulle potentiellt påverkas av små molekyler som används i en skärm. Ett tangentiellt fråga är det faktum att cellbaserad analys ger ingen information om mekanismen bakom förändringar i nivåerna av intracellulär c-di-GMP. Därför måste viktiga observationer från försök bekräftas med användning av en HPLC-masspektrometri tillvägagångssätt, som anses vara den "gyllene standard" -metoden för mätning av intracellulära c-di-GMP fluktuationer i bakterier. Vidare kan vårt förfarande endast ge information om beteendet hos bakterier som odlas in vitro, såsom bakterieceller odlas i samband med värden (in vivo) snabbt ändra sin verksamhet på grund av denna miljö. Dessutom innebär processen med hjälp av en GFP bioreporter skärmen tar intehänsyn till den fysiologiska status av bakteriecellerna. Emellertid skulle det protokoll anpassas till mikroskopisk övervakning av enskilda brunnar under loppet av skärmen.
Även med dessa överväganden och begränsningar, är det hög genomströmning analys fortfarande en robust skärm för små molekyler med förmåga att störa intracellulära c-di-GMP nivåer. Eftersom många mikrobiella arter, inklusive många bakteriella patogener har studerats i syfte att karakterisera den modulering av intracellulära c-di-GMP nivåer, kunde våra protokoll appliceras till olika bakteriearter och expanderas till studiet av mer komplexa flerartsbakteriemodeller. Analysen kan lätt optimeras för andra bakteriearter genom att ändra tillväxtbetingelserna som används, eller kan anpassas för att läsa andra utgångar med hjälp av olika bioreporters. Olika inkubationstider kan appliceras beroende på tillväxtfasen av intresse. Emellertid, när uppskalning eller öka genom-put, är det importan t att hålla i minnet att bakterierna fortfarande kommer att växa under plattpreparat och läs-mätningar. Därför rekommenderas att screena maximalt 15 plattor på en gång med hjälp av detta protokoll. Dessutom, med hjälp av plattor med mer än 384 brunnar inte tillåter en enhetlig tillväxt, vilket kräver ytterligare optimering. När nedskalning antalet plattor, kan det vara lämpligare att manuellt ympa med hjälp av en elektronisk pipett i stället för en vätskehanteringsrobot. Det är tydligt att detta protokoll kan användas för att undersöka små molekyler som dispergerar biofilmer, med tanke på att anti-biofilm föreningar interfererar med c-di-GMP-signalering. Protokollet skulle också kunna byggas om för att förstå olika aspekter av bakteriell fysiologi. Med tanke på att c-di-GMP signalering är utbredd i de flesta bakterier, genom att studera physiologies av dessa organismer med hjälp av detta protokoll vi kan identifiera olika kemiska stimuli för att avgöra huruvida deras arbetsmekanismer kräver c-di-GMP-signalering.
_content "> Sammanfattningsvis kommer robust och mångsidigheten hos den metod som anges i detta protokoll underlätta identifiering av kemiska modulatorer av c-di-GMP signalering i många biologiska system.The authors have nothing to disclose.
We thank the Tolker-Nielsen lab for their generous donation of reporter constructs used to develop the screen. We also thank members of the Ryan laboratory for their helpful comments and critical reading of the manuscript. The work of the authors has been supported in part by grants awarded by the Wellcome Trust (WT100204AIA senior fellowship grant to R.P.R. and 093714/Z/10/Z PhD scholarship to K.N.R.).
Lysogeny Broth (Lennox) | Sigma Aldrich | L3022-1KG |
Sucrose | Sigma Aldrich | S0389-1KG |
Lysogeny Broth with Agar (Lennox) | Sigma Aldrich | L2897-1KG |
Ampicillin sodium | Sigma Aldrich | A0166-25G |
Glycerol | Sigma Aldrich | G5516-1L |
Phosphate Buffered Saline, pH 7.4 | Life technologies | 10010-056 |
Tobramycin sulfate | Sigma Aldrich | T1783-100MG |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | 276855-250ML |
Genesys 10S UV-Vis spectrophotometer | Thermoscientific | 840-208100 |
2 mm gap electroporator cuvette | Bio-Rad | 1652092 |
BioRad GenePulser XCell electroporator | Bio-Rad | 1652662 |
Leica Fluorescent Stereomicroscope | Leica Microsystems | MZ16FA |
BRAND magnetic stirring bar, PTFE, cylindrical with pivot ring (sterilise by autoclaving before use) | Sigma Aldrich | Z328952-10EA |
384-well, white-walled, clear-bottom plates | Greiner | 781098 |
Multidrop Combi reagent dispenser | Thermo Scientific | 5840300 |
Multidrop Combi tubing | Thermo Scientific | 24073290 |
VIAFLO II 16-channel electronic pipette | Integra Biosciences | 4642 |
100 mL sterile disposable reagent reservoirs | Fisher Scientific | 12399175 |
AeraSeal air-permeable membranes | Sigma Aldrich | MKBQ1886 |
Pherastar plate reader (Software version: 4.00 R4, Firmware version: 1.13) | BMG Labtech | Pherastar FS |