Photostable cyanine dyes are attached to oligonucleotides to monitor hybridization by energy transfer.
בפרוטוקול זה, אנחנו מדגימים שיטה לסינתזה של 2'-אלקין שונה חומצת deoxyribonucleic (DNA) גדילים בסינתזת שלב מוצק אוטומטית באמצעות כימית phosphoramidite סטנדרטית. Oligonucleotides מסומנים שלאחר סינטטי על ידי שני צבעים cyanine photostable חדשים באמצעות זרז-נחושת-כימיה קליק. הסינתזה של שניהם צבע תורם acceptor מתוארת והיא מבוצעת בשלושה שלבים רצופים. עם DNA כמו הארכיטקטורה שמסביב, הצבעים שני אלה עוברים מעבר אנרגיה כשהם מובאים לתוך בסמיכות ידי כלאה. לכן, חישול של שני גדילי DNA גדילי יחיד הוא מדמיין על ידי שינוי של צבע פלואורסצנטי. שינוי צבע זה מאופיין ספקטרוסקופיה פלואורסצנטי אבל יכול להיות גם ציין ישירות באמצעות מנורת כף יד אולטרה סגול (UV). הקונספט של הודעת צבע פלואורסצנטי כפולה עושה בדיקות oligonucleotide אלה כלי מעולה עבור הדמיה מולקולרית במיוחד כאשר Pho תארצבעי tostable משמשים. ובכך, photobleaching של בדיקות ההדמיה נמנע, ותהליכים ביולוגיים ניתן לצפות בזמן אמת עבור תקופת זמן ארוכה יותר.
הדמיה מולקולרית מייצגת טכניקה בסיסית להבנת תהליכים ביולוגיים בתוך תאי חיים. 1-3 פיתוח בדיקות מבוססות חומצת פלורסנט גרעין עבור יישומים כימיים-ביולוגית כזה הפך לשדה מחקר הרחבה. בדיקות ניאון אלו צריכים לעמוד בכמה דרישות הופכים לכלי שרת מתאים הדמיה תא. ראשית, צבעים מיושם צריך להפגין הקרינה עם תשואות קוונטית גבוהה, משמרות 'גדול סטוקס, והכי חשוב, photostabilities גבוה כדי לאפשר לטווח ארוך בתחום ההדמיה vivo. ושנית, הם צריכים להראות הודעת קרינה אמינה. כרומופור-מרווה-מערכות קונבנציונליות מבוססות על ההודעה של צבע פלואורסצנטי אחת על ידי שינויים פשוטים עוצמות קרינה. 4 גישה זו נושאה את הסיכון של תוצאות שליליות חיוביות או שקר שקר בשל autofluorescence של רכיבים תאיים או יחסי אות לרעש נמוכים בשל מרווה רצוי על ידי com האחרponents. 4
דיווחנו לאחרונה על הרעיון של "רמזור DNA" שמראה readouts צבע פלואורסצנטי הכפול באמצעות שני chromophores שונה. 5-6 התפיסה מבוססת על העברת האנרגיה (ET) מ צבען התורם כדי לצבוע acceptor אשר משנה את הקרינה צבע (ראה איור 1). זה מאפשר הודעה אמינה יותר ובכך מספק כלי רב עצמה עבור בדיקות דימות פלואורסצנטי. תוויות של oligonucleotides עם צבעי ניאון יכול להיות מושגת על ידי שתי גישות שונות. צבעים ניתן לשלב במהלך סינתזת ה- DNA הכימית על שלב מוצק באמצעות אובניים בניין phosphoramidite שונה בהתאם. 7 שיטה זו מוגבלת צבעים כי הם יציבים בתנאי phosphoramidite ו deprotection סטנדרטיים. כחלופה, מתודולוגיות שינוי שלאחר סינתטי הוקמו בכימיה oligonucleotide. הנה, אנחנו מדגימים את הסינתזה של אחד התמונות החדשות שלנושולחן אנרגיה העברת זוגות 8,9 ואת תיוג שלאחר סינתטי של דנ"א באמצעות-זרז נחושת 1,3-cycloaddition בין azides ו alkynes (CuAAC). 10
פרוטוקול זה מראה את הנוהל המלא לתייג DNA שלאחר סינטטי באמצעות CuAAC ידי צבעי ניאון-modified יזידו. זה כולל את הסינתזה של צבעים ואת DNA שונה-אלקין וכן הליך התיוג.
הסינתזה של צבעים כדלקמן ארבעה שלבים. כל המוצרים ניתן להשיג על ידי משקעים פש?…
The authors have nothing to disclose.
תמיכה כספית על ידי (DFG, ווה 1386 / 17-1), את GRK קבוצת הדרכת המחקר 2039 (ממומן על ידי DFG) והערכה היא הודתה בהכרת תודה.
synthesis | |||
4-Picoline | Sigma Aldrich | 239615 | |
1,3-Diiodopropane | Sigma Aldrich | 238414 | |
Acetonitrile | Fisher Scientific | 10660131 | HPLC grade |
Ethyl acetate | Fisher Scientific | 10456870 | technical grade |
Sodium azide | Sigma Aldrich | 71290 | p.a. grade |
Dichloromethane | Fisher Scientific | 10626642 | technical grade |
Indole-3-carboxaldehyde; 98% | ABCR | AB112969 | |
Potassium carbonate, 99+% | Acros | 424081000 | |
dimethylcarbonate | Sigma Aldrich | 517127 | |
N,N-Dimethylformamide, 99.8%, Extra Dry over Molecular Sieve | Acros | 348435000 | |
Sodium sulfate | Bernd Kraft | 12623.46 | |
Ethanol, 99.5% | Acros | 397690010 | |
Piperidine, 99% | Acros | 147181000 | |
Diethylether | Fisher Scientific | 10407830 | technical grade |
2-Phenylindole-3-carboxaldehyde; 97% | ABCR | AB125050 | |
4-Methylquinoline | ABCR | AB117222 | |
DNA synthesis | |||
Expedite 8909 Nucleic Acid Synthesizer | Applied Biosystems | - | |
DMT-dA(bz) Phosphoramidite | Sigma Aldrich | A111081 | |
DMT-dT Phosphoramidite | Sigma Aldrich | T111081 | |
DMT-dG(dmf) Phosphoramidite | Sigma Aldrich | G11508 | |
DMT-dC(bz) Phosphoramidite | Sigma Aldrich | C11108 | |
Amidite Diluent for DNA synthesis | Sigma Aldrich | L010010 | |
Ultrapure Acetonitrile for DNA synthesis | Sigma Aldrich | L010400 | |
Cap A | Sigma Aldrich | L840000 | |
Cap B | Sigma Aldrich | L850000 | |
CPG dT Column 1.0 µmole | Proligo Reagents | T461010 | |
CPG dA(bz) Column 1.0 µmole | Proligo Reagents | A461010 | |
CPG dG(ib) Column 1.0 µmole | Proligo Reagents | G461010 | |
CPG dC(bz) Column 1.0 µmole | Proligo Reagents | C461010 | |
ammonia (aqueous solution) | Fluka Analytical | 318612 | |
centrifugal devices nanosep 0.45 µm | Pall | ODGHPC34 | |
5-(Benzylthio)-1H-tetrazole (Activator) | Sigma Aldrich | 75666 | |
2'-O-propargyl deoxyuridinephosphoramidite | Chem Genes | ANP-7754 | |
workup | |||
vacuum concentrator | Christ | ||
clicking procedure | |||
Tetrakis(acetonitrile)copper(I) hexafluorophosphate | Sigma Aldrich | 346276 | |
Sodium acetate | Sigma Aldrich | S2889 | |
(+)-Sodium L-ascorbate | Sigma Aldrich | A7631 | |
EDTA disodium salt | Sigma Aldrich | E5134 | |
TBTA-ligand | - | - | synthesized according to a literature procedure [1] |
HPLC | |||
HPLC-system | Shimadzu | ||
MALDI-Biflex-IV spectrometer | Bruker Daltonics | ||
LC-318 C18 column | Supelcosil via Sigma Aldrich | 58368 | |
determination of concentration | |||
ND 1000 Spectrophotometer | nanodrop | ||
sample preparation and spectroscopy | |||
Cary 100 Bio | Varian | ||
Fluoromax-3 fluorimeter | Jobin-Yvon | ||
[1] R. Chan Timothy, R. Hilgraf, K. B. Sharpless, V. Fokin Valery, Org Lett 2004, 6, 2853-2855. |