Síntese de DNA sondas de hibridação de mudança de comprimento de onda usando fotoestável Cyanine Corantes
Summary
Photostable cyanine dyes are attached to oligonucleotides to monitor hybridization by energy transfer.
Abstract
Neste protocolo, demonstramos um método para a síntese de 2'-alcino modificado cadeias de ácido desoxirribonucleico (ADN) por síntese em fase sólida automatizados usando a química fosforamidite padrão. Oligonucleotídeos são pós-sinteticamente marcado por dois novos corantes cianina fotoestáveis usando click-química catalisada por cobre. A síntese de ambos os corantes dador e aceitador é descrita e é realizado em três etapas consecutivas. Com o ADN como a arquitectura envolvente, estes dois corantes submetidos a uma transferência de energia quando eles são colocados em estreita proximidade por hibridação. Portanto, emparelhamento de duas cadeias de ADN de cadeia simples é visualizada por uma mudança de cor de fluorescência. Esta mudança de cor é caracterizado por espectroscopia de fluorescência, mas pode também ser directamente observada por utilização de uma lâmpada ultravioleta de mão (UV). O conceito de uma leitura de cor de fluorescência dupla faz com que essas sondas de oligonucleotídeos excelentes ferramentas para imagiologia molecular, especialmente quando o pho descritacorantes tostable são utilizados. Deste modo, as sondas fotodegradação de imagiologia é prevenida, e os processos biológicos pode ser observada em tempo real durante um período de tempo mais longo.
Introduction
A imagem molecular representa uma técnica fundamental para a compreensão dos processos biológicos dentro de células vivas. 1-3 O desenvolvimento de sondas fluorescentes de ácidos nucleicos com base para tais aplicações químico-biológica tornou-se um campo de pesquisa em expansão. Estas sondas fluorescentes precisam atender a alguns requisitos para se tornar as ferramentas apropriadas para imagens de células. Em primeiro lugar, os corantes aplicados devem apresentam uma fluorescência com elevados rendimentos quânticos, os desvios grandes Stokes "e, mais importante ainda, elevados photostabilities para permitir a longo prazo in vivo de imagens. E em segundo lugar, devem mostrar uma leitura de fluorescência fiável. Convencional cromóforo-quencher-sistemas são baseados na leitura de uma única cor de fluorescência por mudanças simples em intensidades de fluorescência. 4 Esta abordagem assume o risco de resultados falsos positivos ou falsos negativos devido a autofluorescência de componentes intracelulares ou baixos rácios de sinal-ruído devido à têmpera indesejada por outro cOMcomponentes. 4
Recentemente, relatou-se no conceito de "semáforos de ADN" que mostram leituras de cor de fluorescência dupla usando dois cromóforos diferentes. 5-6 O conceito baseia-se na transferência de energia (ET) a partir do corante dador do corante aceitador à qual muda a fluorescência cor (ver Figura 1). Isto permite uma leitura mais fiável e, assim, fornece uma ferramenta poderosa para sondas de imagem fluorescentes. Rotulagem dos oligonucleótidos com corantes fluorescentes pode ser conseguida por duas abordagens diferentes. Os corantes podem ser incorporados durante a síntese química de ADN sobre uma fase sólida, utilizando blocos de construção de fosforamidite correspondentemente modificados. 7 Este método é limitado aos corantes que sejam estáveis sob as condições de desprotecção e de fosforamidite padrão. Como alternativa, as metodologias de modificação pós-sintética foram estabelecidas na química de oligonucleótidos. Aqui, nós demonstramos a síntese de um dos nossos novos fotosenergia tabela de pares de transferência de 8,9 e a rotulagem de pós-sintética de DNA usando catalisada por cobre 1,3-cicloadição entre azidas e alcinos (CuAAC). 10
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo mostra o procedimento completo para rotular DNA pós-sinteticamente através CuAAC por corantes fluorescentes modificados-azida. Isto inclui a síntese dos corantes e o ADN modificado com alcino, bem como o procedimento de marcação.
A síntese dos corantes seguintes quatro passos. Todos os produtos podem ser obtidos por uma precipitação em vez simples, devido à sua carga positiva e sem cromatografia em coluna demorado é necessária. A introdução das funcionalidades azi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
apoio financeiro por parte da Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Wa 1386 / 17-1), o Research Training Grupo GRK 2039 (financiado pela DFG) e KIT é reconhecido agradecimento.
Materials
| synthesis | |||
| 4-Picoline | Sigma Aldrich | 239615 | |
| 1,3-Diiodopropane | Sigma Aldrich | 238414 | |
| Acetonitrile | Fisher Scientific | 10660131 | HPLC grade |
| Ethyl acetate | Fisher Scientific | 10456870 | technical grade |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | 71290 | p.a. grade |
| Dichloromethane | Fisher Scientific | 10626642 | technical grade |
| Indole-3-carboxaldehyde; 98% | ABCR | AB112969 | |
| Potassium carbonate, 99+% | Acros | 424081000 | |
| dimethylcarbonate | Sigma Aldrich | 517127 | |
| N,N-Dimethylformamide, 99.8%, Extra Dry over Molecular Sieve | Acros | 348435000 | |
| Sodium sulfate | Bernd Kraft | 12623.46 | |
| Ethanol, 99.5% | Acros | 397690010 | |
| Piperidine, 99% | Acros | 147181000 | |
| Diethylether | Fisher Scientific | 10407830 | technical grade |
| 2-Phenylindole-3-carboxaldehyde; 97% | ABCR | AB125050 | |
| 4-Methylquinoline | ABCR | AB117222 | |
| DNA synthesis | |||
| Expedite 8909 Nucleic Acid Synthesizer | Applied Biosystems | - | |
| DMT-dA(bz) Phosphoramidite | Sigma Aldrich | A111081 | |
| DMT-dT Phosphoramidite | Sigma Aldrich | T111081 | |
| DMT-dG(dmf) Phosphoramidite | Sigma Aldrich | G11508 | |
| DMT-dC(bz) Phosphoramidite | Sigma Aldrich | C11108 | |
| Amidite Diluent for DNA synthesis | Sigma Aldrich | L010010 | |
| Ultrapure Acetonitrile for DNA synthesis | Sigma Aldrich | L010400 | |
| Cap A | Sigma Aldrich | L840000 | |
| Cap B | Sigma Aldrich | L850000 | |
| CPG dT Column 1.0 µmole | Proligo Reagents | T461010 | |
| CPG dA(bz) Column 1.0 µmole | Proligo Reagents | A461010 | |
| CPG dG(ib) Column 1.0 µmole | Proligo Reagents | G461010 | |
| CPG dC(bz) Column 1.0 µmole | Proligo Reagents | C461010 | |
| ammonia (aqueous solution) | Fluka Analytical | 318612 | |
| centrifugal devices nanosep 0.45 µm | Pall | ODGHPC34 | |
| 5-(Benzylthio)-1H-tetrazole (Activator) | Sigma Aldrich | 75666 | |
| 2'-O-propargyl deoxyuridinephosphoramidite | Chem Genes | ANP-7754 | |
| workup | |||
| vacuum concentrator | Christ | ||
| clicking procedure | |||
| Tetrakis(acetonitrile)copper(I) hexafluorophosphate | Sigma Aldrich | 346276 | |
| Sodium acetate | Sigma Aldrich | S2889 | |
| (+)-Sodium L-ascorbate | Sigma Aldrich | A7631 | |
| EDTA disodium salt | Sigma Aldrich | E5134 | |
| TBTA-ligand | - | - | synthesized according to a literature procedure [1] |
| HPLC | |||
| HPLC-system | Shimadzu | ||
| MALDI-Biflex-IV spectrometer | Bruker Daltonics | ||
| LC-318 C18 column | Supelcosil via Sigma Aldrich | 58368 | |
| determination of concentration | |||
| ND 1000 Spectrophotometer | nanodrop | ||
| sample preparation and spectroscopy | |||
| Cary 100 Bio | Varian | ||
| Fluoromax-3 fluorimeter | Jobin-Yvon | ||
| [1] R. Chan Timothy, R. Hilgraf, K. B. Sharpless, V. Fokin Valery, Org Lett 2004, 6, 2853-2855. |
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