Os corantes fotoestáveis de cianina são ligados a oligonucleotídeos para monitorar a hibridização por transferência de energia.
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Artigo de método
Síntese de DNA sondas de hibridação de mudança de comprimento de onda usando fotoestável Cyanine Corantes
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Neste protocolo, demonstramos um método para a síntese de 2'-alcino modificado cadeias de ácido desoxirribonucleico (ADN) por síntese em fase sólida automatizados usando a química fosforamidite padrão. Oligonucleotídeos são pós-sinteticamente marcado por dois novos corantes cianina fotoestáveis usando click-química catalisada por cobre. A síntese de ambos os corantes dador e aceitador é descrita e é realizado em três etapas consecutivas. Com o ADN como a arquitectura envolvente, estes dois corantes submetidos a uma transferência de energia quando eles são colocados em estreita proximidade por hibridação. Portanto, emparelhamento de duas cadeias de ADN de cadeia simples é visualizada por uma mudança de cor de fluorescência. Esta mudança de cor é caracterizado por espectroscopia de fluorescência, mas pode também ser directamente observada por utilização de uma lâmpada ultravioleta de mão (UV). O conceito de uma leitura de cor de fluorescência dupla faz com que essas sondas de oligonucleotídeos excelentes ferramentas para imagiologia molecular, especialmente quando o pho descritacorantes tostable são utilizados. Deste modo, as sondas fotodegradação de imagiologia é prevenida, e os processos biológicos pode ser observada em tempo real durante um período de tempo mais longo.
Introdução
A imagem molecular representa uma técnica fundamental para a compreensão dos processos biológicos dentro de células vivas. 1-3 O desenvolvimento de sondas fluorescentes de ácidos nucleicos com base para tais aplicações químico-biológica tornou-se um campo de pesquisa em expansão. Estas sondas fluorescentes precisam atender a alguns requisitos para se tornar as ferramentas apropriadas para imagens de células. Em primeiro lugar, os corantes aplicados devem apresentam uma fluorescência com elevados rendimentos quânticos, os desvios grandes Stokes "e, mais importante ainda, elevados photostabilities para permitir a longo prazo in vivo de imagens. E em....
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Protocolo
Cuidado: Por favor, consulte todas as folhas de dados de segurança pertinentes (MSDS) antes do uso. Muitos dos produtos químicos usados nestas sínteses são tóxicos e cancerígenos. Por favor, use todas as práticas de segurança apropriadas que são normalmente exigidos em laboratórios de química orgânica, tais como vestindo uma bata de laboratório, óculos de segurança e luvas.
1. Sintese dos corantes
Nota: ambos os corantes podem ser sintetizados pelos mesmos tipos de reacção Figura 2 mostra uma visão geral destas reacções..
- Síntese de 1- (3-azidopropil) -4- (2- (1-metil-1H-i....
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Resultados
Absorção e espectros de fluorescência do ADN de cadeia dupla e são registados como mostrado na Figura 4.
O espectro de absorção gravado (Figura 4 à direita) mostra a absorção maxima λ max a 465 nm para DNA1 de cadeia simples (dye 1) e 546 nm para DNA2 de cadeia simples (corante 2). O DNA1_2 recozido (corante corante 1 & 2) apresenta máximos a 469 nm e ambos 567 nm. Ambos máximos.......
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Discussão
Este protocolo mostra o procedimento completo para rotular DNA pós-sinteticamente através CuAAC por corantes fluorescentes modificados-azida. Isto inclui a síntese dos corantes e o ADN modificado com alcino, bem como o procedimento de marcação.
A síntese dos corantes seguintes quatro passos. Todos os produtos podem ser obtidos por uma precipitação em vez simples, devido à sua carga positiva e sem cromatografia em coluna demorado é necessária. A introdução das funcionalidades azida antes dos .......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
apoio financeiro por parte da Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Wa 1386 / 17-1), o Research Training Grupo GRK 2039 (financiado pela DFG) e KIT é reconhecido agradecimento.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| synthesis | |||
| 4-Picoline | Sigma Aldrich | 239615 | |
| 1,3-Diiodopropano | Sigma Aldrich | 238414 | |
| Acetonitrila | Fisher Scientific | 10660131 | HPLC grau |
| acetato de etila | Fisher Scientific | 10456870 | grau técnico |
| azida | de sódioSigma Aldrich | 71290 | p.a. grau |
| Diclorometano | Fisher Científico | 10626642 | grau técnico |
| Indole-3-carboxaldeído; 98% | ABCR | AB112969 | |
| carbonato de potássio, 99 + % | Acros | 424081000 | |
| dimetilcarbonato | Sigma Aldrich | 517127 | |
| N, N< / em>-Dimetilformamida, 99,8%, Extra Seco sobre Peneira Molecular | Acros | 348435000 | |
| Sulfato de Sódio | Bernd Kraft | 12623,46 | |
| Etanol, 99,5% | Acros | 397690010 | |
| Piperidina, 99% | Acros | 147181000 | |
| Diethylether | Fisher Scientific | 10407830 | grau técnico |
| 2-Fenilindol-3-carboxaldeído; 97% | ABCR | AB125050 | |
| 4-Metilquinolina | ABCR | AB117222 | |
| DNA synthesis | |||
| Expedite 8909 Nucleic Acid Synthesizer | Applied Biosystems | - | |
| DMT-dA(bz) Phosphoramidite | Sigma Aldrich | A111081 | |
| DMT-dT Phosphoramidite | Sigma Aldrich | ||
| DMT-dG (dmf) Fosforamidita | Sigma Aldrich | G11508 | |
| DMT-dC (bz) Fosforamidita | Sigma Aldrich | C11108 | |
| Diluente de Amidita para síntese de DNA | Sigma Aldrich | L010010 | |
| Acetonitrila ultrapura para síntese de DNA | Sigma Aldrich | L010400 | |
| Cap A | Sigma Aldrich | L840000 | |
| Cap B | Sigma Aldrich | L850000 | |
| CPG dT Coluna 1.0 µ reagentes | mole Proligo | T461010 | |
| CPG dA(bz) Coluna 1.0 µ reagentes | mole Proligo | A461010 | |
| CPG dG(ib) Coluna 1.0 µ Reagentes | Mole Proligo | G461010 | |
| CPG dC(bz) Coluna 1.0 µ reagentes mole | Proligo | C461010 | |
| amônia (solução aquosa) | Fluka Analytical | ||
| nanosep 0.45 µ m | Pall | ODGHPC34 | |
| 5- (Benziltio) -1H-tetrazol (Ativador) | Sigma Aldrich | 75666 | |
| 2'-O-propargyl desoxiuridinafosforamidite | Chem Genes | ANP-7754 | |
| workup | |||
| vacuum concentrador | Christ | ||
| click | |||
| Tetrakis (acetonitrila) cobre (I) hexafluorofosfato | Sigma Aldrich | 346276 | |
| acetato de sódio | Sigma Aldrich | S2889 | |
| (+) -Sodium L-ascorbato | Sigma Aldrich | A7631 | |
| EDTA sal dissódico | Sigma Aldrich | E5134 | |
| TBTA-ligante | - | - | sintetizado de acordo com um procedimento da literatura1 |
| HPLC | |||
| HPLC-system | Shimadzu | ||
| MALDI-Biflex-IV espectrômetro | Bruker Daltonics | ||
| LC-318 C18 coluna | Supelcosil via Sigma Aldrich | 58368 | |
| determinação da concentração | |||
| ND 1000 Espectrofotômetro | nanodrop | ||
| preparação e espectroscopia de amostras | |||
| Cary 100 Bio | Varian | ||
| Fluoromax-3 fluorímetro | Jobin-Yvon | ||
| 1 R. Chan Timothy, R. Hilgraf, K. B. Sharpless, V. Fokin Valery, Org Lett 2004, 6, 2853-2855. |
Referências
- Kobayashi, H., Ogawa, M., Alford, R., Choyke, P. L., Urano, Y. New strategies for fluorescent probe design in medical diagnostic imaging. Chem Rev. 110 (5), 2620-2640 (2010).
- Berezin, M. Y., Achilefu, S. Fluorescence Lifetime Measurements and Biological Imaging. Chem. Rev.
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Reimpressões e permissões
