サイト監督スピン標識および五量体リガンド依存性イオンチャネルのEPR分光研究
Summary
This article describes methods for site-directed spin labeling and reconstitution of pentameric ligand-gated channels for Electron Paramagnetic Resonance studies. This protocol can be adapted for any membrane protein. The reconstitution method described here can also be used for patch-clamp measurements of macroscopic and single-channel currents in a defined lipid system.
Abstract
Ion channel gating is a stimulus-driven orchestration of protein motions that leads to transitions between closed, open, and desensitized states. Fundamental to these transitions is the intrinsic flexibility of the protein, which is critically modulated by membrane lipid-composition. To better understand the structural basis of channel function, it is necessary to study protein dynamics in a physiological membrane environment. Electron Paramagnetic Resonance (EPR) spectroscopy is an important tool to characterize conformational transitions between functional states. In comparison to NMR and X-ray crystallography, the information obtained from EPR is intrinsically of lower resolution. However, unlike in other techniques, in EPR there is no upper-limit to the molecular weight of the protein, the sample requirements are significantly lower, and more importantly the protein is not constrained by the crystal lattice forces. Therefore, EPR is uniquely suited for studying large protein complexes and proteins in reconstituted systems. In this article, we will discuss general protocols for site-directed spin labeling and membrane reconstitution using a prokaryotic proton-gated pentameric Ligand-Gated Ion Channel (pLGIC) from Gloeobacter violaceus (GLIC) as an example. A combination of steady-state Continuous Wave (CW) and Pulsed (Double Electron Electron Resonance-DEER) EPR approaches will be described that will enable a complete quantitative characterization of channel dynamics.
Introduction
過去10年間、五量体リガンド依存性イオンチャネル（pLGIC）の構造的理解は、家族のいくつかのメンバーの高分解能構造の群衆に起因して、飛躍的に成長してきました。フィールド内の現在の進歩につながった主な要因は、構造決意アプローチ中の原核pLGICチャンネルの発見、真核生物の膜タンパク質の発現に1-3主要な進展、4-6と驚異的なブレークスルーを含む。7これらの構造は、上の明確なコンセンサスを提供しますpLGICの3次元構造の全体的な保全。しかし、背後に引きずるように見える二つの主要な分野は、これらのチャネル製剤の機能的特徴およびチャネル機能のメカニズムの説明があります。
ゲーティングコンフォメーション変化は複雑であり、チャネルの長さに沿って60オングストロームの距離にわたって起こり、これらの遷移は広くによって調節されます膜脂質。具体的には、負の脂質、コレステロール、およびリン脂質はpLGIC 8-11の機能を調節することが示されています。チャネル機能におけるこれらの脂質成分の正確な役割は不明のままであるが、ゲーティングの完全な分子的理解は、彼らのネイティブ環境でこれらのチャネルを研究が必要となります。部位特異的スピンラベリング（SDSL）および電子常磁性共鳴（EPR）分光法は、再構成されたシステムでは、タンパク質のダイナミクスを研究するための選択肢の技術です。 EPR分光法（蛍光分光法のように）分子の大きさ（NMRのように）、またはサンプルの光学的特性によって制限され、それによって天然の脂質状態に再構成全長構築物の測定が可能です。技術は非常に敏感であり、（ピコモルの範囲内で）比較的低いサンプル要件があります。これらの両方の側面がミリグラム以上で表現することが困難な大規模な膜タンパク質を研究するための技術は非常に適して作ります量。
部位特異的スピン標識と組み合わせて、EPR分光法を使用することは、ウェインハベルらによって開発された、およびタンパク質の種類の範囲を研究するために適合されている。12-24 EPRデータは、二次構造を調査するために使用されている、タンパク質の変化を立体構造、膜挿入深さ、およびタンパク質 – タンパク質/タンパク質 – リガンド相互作用。
この方法は、部位特異的突然変異誘発により、目的の位置にシステイン置換を含みます。部位特異的な標識化を確実にするために、システインレステンプレートを作成する別のアミノ酸（ 例えば 、セリン）で天然のシステインを置換することが必要です。これまでのところ、最も人気のあるスピン標識は、チオール特異的MTSLである：（1-オキシル2,2,5,5-テトラメチルΔ3-ピロリン-3-メチル）ジスルフィド結合のブリッジを介してタンパク質に付着methanethiosulfonate。その高い特異性、比較的小さいサイズ（トリプトファンよりわずかに大きい）、およびフレキシへリンカー領域の性は、このスピン標識も埋め込みシステインに優れた反応性を有することが示されています。さらに、反応性を最大化するために、タンパク質の標識反応は、界面活性剤可溶化形態で行われます。サイズ排除クロマトグラフィーにより過剰の遊離スピン標識を分離した後、タンパク質は、リポソームまたは定義された脂質組成物の二重層模倣システムに再構成されています。一般的には、システイン突然変異誘発はよくタンパク質のほとんどの地域では許容され、かつスピンプローブの比較的小さいサイズは、二次および三次構造に最小限の摂動を引き起こします。修飾は、野生型の機能を保持することを保証するために、標識され、再構成されたチャネルは、パッチクランプ測定によって研究することができます。
標識機能性タンパク質は、その後、本質的に情報の主に3つのタイプを提供する分光測定に供される：lineshにより12,14,15,20,22,23,25-27スピンプローブダイナミクスを猿の分析;常磁性緩和剤に対するプローブのアクセス;距離分布27 EPR距離は、2つの異なるアプローチによって測定されます。最初は（8 – 20Åの距離範囲）をスピン標識との間の双極子相互作用に起因するスペクトルの広がりは連続波（CW）技術に基づいている。距離を決定するために使用されている28,29秒パルス、EPRであります距離測定は、二重電子電子共鳴（DEER）で70Å。30-34にまで拡張することができる方法は、スピンエコー振幅の振動は、距離と距離の分布を決定するために分析されます。ここでのスピンエコーは双極子相互作用の周波数で変調されます。一緒に、これらのパラメータは、タンパク質のトポロジーは、二次構造要素、およびタンパク質コンホメーション変化を決定するために使用されます。
Protocol
Representative Results
Discussion
EPR分光法はネイティブに近い環境での膜タンパク質の立体構造変化を定量化するに比類のない構造的アプローチであることが証明されました。このアプローチは、私たちにX線結晶構造解析とクライオ電子顕微鏡から高解像度の構造に隠されているタンパク質のダイナミクスの分子の詳細にのぞき見することができます。しかし、他のシステムへの一般的な適用に影響を与える可能性があり?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、原稿上の重要な読書とコメントChakrapaniラボの現在および過去のメンバーに非常に感謝しています。 この作品は、国立衛生研究所の助成金（1R01GM108921）とアメリカ心臓協会（NCRPサイエンティスト開発グラント12SDG12070069）によって、およびSCにサポートされていました。
Materials
| Site-Directed Mutagenesis and Cys mutations | |||
| 10x PfuUltra HF reaction buffer | Agilent Technologies | 600380-52 | |
| dNTPS | New England BioLabs Inc | N0447L | 10mM each dNTP |
| pfu Ultra DNA polymerase | Agilent Technologies | 600380-51 | 2.5 U/ul |
| DPNI | New England BioLabs Inc | R0176S | 20,000 U/ml |
| XL10 GOLD | Agilent Technologies | 200314 | |
| SOC media | New England BioLabs Inc | B9020S | |
| Kanamycin | Fisher Scientfic | BP905 | |
| LB media | Invitrogen | 127957084 | |
| Miniprep kit | QIAGEN | 27106 | |
| C43 competent cells | Lucigen | 60446 | |
| Expression and Purification | |||
| Glucose | Fisher Scientfic | D16 | |
| Tryptone | Fisher Bioreagents | BP1421-500 | |
| Yeast extract | Amresco | J850 | |
| Glycerol | Fisher Bioreagents | BP229 | |
| K2HPO4 | Amresco | 0705 | |
| KH2PO4 | Amresco | 0781 | |
| IPTG (isopropyl-thio-β-galactoside) | Gold Biotechnology | I2481C25 | |
| Trizma Base | Sigma Life Science | T1503 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| DNase I | Sigma Life Science | DN25 | |
| PMSF | Amresco | M145 | |
| Leupeptine | Amresco | J580 | |
| Pepstatin | Amresco | J583 | |
| DDM (n-Docecyl-β-D-Maltopyranoside) | Anatrace | D310S | |
| Amylose resin | New England BioLabs Inc | E8021L | |
| TCEP | Amresco | K831 | |
| EDTA | Fisher Scientfic | BP118 | |
| Maltose | Acros Organics | 329915000 | |
| Superdex 200GL | GE Healthcare | 17-5175-01 | |
| Empty polypropylene Chromatography column | BioRad | 731-1550 | |
| Site-Directed Spin Labeling | |||
| MTSL (1-oxyl-2,2,5,5-tetramethyl-3-pyrroline-3-methyl) Methanethiosulfonate | Toronto Reaserch chemicals Inc | O873900 | |
| (1-acetoxy-2,2,5,5-tetramethyl-Δ3-pyrroline-3-methyl) methanethiosulfonate | Toronto Reaserch chemicals Inc | A167900 | |
| DMSO | J.T. Baker | 9224-01 | |
| Reconstitution | |||
| Asolectin lipid | Avanti polar lipids Inc | 541602C | |
| Biobeads (Polystyrine beads) | Bio Rad | 152-3920 | |
| Methanol | Fisher chemicals | A413 | |
| FRET | |||
| Fluorescein-maleimide | ThermoFisher Scientific | F-150 | |
| Tetramethylrhodamine-maleimide | ThermoFisher Scientific | T-6027 | |
| POPC | Avanti polar lipids Inc | 850457C | |
| POPG | Avanti polar lipids Inc | 840457C | |
| E.Coli polar lipid extract | Avanti polar lipids Inc | 100600C | |
| HEPES | Sigma Life Science | H3375 | |
| EPR measurement | |||
| TPX plastic capillaries | Bruker | ER221 | |
| EDDA (Ethylenediamine-N, N'-diacetic acid) | Aldrich | 158186 | |
| Ni(OH)2 | Aldrich | 283622 |
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