Summary

Высокочувствительных и быстрое обнаружение флуоресценция с помощью портативного анализатора FRET

Published: October 01, 2016
doi:

Summary

Этот протокол описывает быструю и высокочувствительную квантификацию Ферстер резонансный перенос энергии (FRET) данных датчиков с использованием заказных портативного анализатора ладу. Устройство было использовано для обнаружения мальтозу в пределах диапазона критических температур, что обеспечивает максимальную чувствительность обнаружения, что позволяет практическую и эффективную оценку содержания сахара.

Abstract

Последние достижения в области Форстера резонансного переноса энергии (FRET) датчики позволили использовать их для обнаружения различных малых молекул, в том числе ионов и аминокислот. Однако врожденная слабая интенсивность сигнала датчиков FRET является серьезной проблемой, которая препятствует их применению в различных областях и делает использование дорогих, высокого класса флуорометры необходимо. Ранее мы создали экономически эффективное, высокопроизводительное FRET анализатор, который может конкретно измерить отношение двух эмиссионных диапазонах длин волн (530 и 480 нм) для достижения высокой чувствительности обнаружения. Совсем недавно было обнаружено, что FRET датчики с бактериальным периплазматических белков, связывающих обнаружить лиганды с максимальной чувствительностью в критическом интервале температур от 50 – 55 ° C. Этот отчет описывает протокол для оценки содержания сахара в коммерчески доступных образцов напитков с использованием нашего портативного анализатора FRET с датчиком температуры FRET конкретного. Наши результаты показали, что дополнительный предварительный нагревПроцесс датчика FRET значительно увеличивает отношение сигнал FRET, чтобы обеспечить более точное измерение содержания сахара. На заказ FRET анализатор и датчик были успешно применены для количественного определения содержания сахара в трех типах коммерческих напитков. Мы ожидаем, что дальнейшее уменьшение размера и производительности улучшение оборудования будет способствовать использованию ручных анализаторов в средах, где высококачественное оборудование не доступно.

Introduction

Ферстер резонансный перенос энергии (FRET) широко используется в качестве биометрический датчик для обнаружения малых молекул , таких как сахара, ионов кальция и аминокислот 1-4. FRET биосенсоры содержат флуоресцентные белки, голубому флуоресцентные белки (СЛТ) и желтый флуоресцентные белки (YFPs), которые сливают с обоих концов периплазматических-связывающего протеина (ПСП). Сугарс связываются с ПСБ, расположенных в середине датчика FRET, вызывая структурные изменения в датчике, который впоследствии варьировал расстояние и дипольным ориентация двух флуоресцирующих белков в любом конце РВР. Это изменение позволяет количественного анализа содержания сахара путем измерения отношения длин волн излучения EYFP (530 нм) и ECFP (480 нм). Благодаря высокой чувствительности, специфичности, возможности мониторинга в режиме реального времени, а также быстрое время отклика FRET биосенсоров, эти датчики широко используются в экологических, промышленных и медицинских применений 5. Кроме того, ratiomИзмерение etric с использованием FRET биосенсоров имеет важные практические преимущества, так как он может быть использован для измерения компонентов в сложных биологических образцах, где концентрация датчик не может легко контролировать и фоновой флуоресценции всегда присутствует.

Несмотря на эти преимущества датчиков на основе FRET для количественной визуализации, небольшие структурные изменения с неполным домена движения-передачи к флуоресцентных белков производят интенсивность по своей сути слабый сигнал. Этот слабый сигнал ограничивает применение датчиков FRET основе для в пробирке или в естественных условиях анализа 6. Следовательно, большинство FRET биосенсоры требуют применения дорогостоящих и высокочувствительного оборудования. Ранее мы разработали недорогой и портативный анализатор ладу возможностями , аналогичными существующих флуоресцентных анализаторов 7. В этом устройстве, недорогой 405-нм диапазона ультрафиолетового света на светоизлучающих диодах (СИД), был использован в качестве источника света, чтобы вызвать возбуждение госигнал флуоресценции е, заменяя дорогую лампу или лазер. Система обнаружения анализатора эффективно фокусирует сигнал флуоресценции рассеивая на двух фотоприемников с кремниевым фотодиодом. В более позднем исследовании мы показали , что оптимизация температуры обнаружения при 50 – 55 ° С может существенно увеличить радиометрический сигнал FRET 8. Это усиление сигнала температуры конкретных, наряду с заказного анализатором FRET, позволяет использовать датчики FRET в более общих диагностических применений с быстрой и высокой чувствительностью.

В этом протоколе мы продемонстрировали общую применимость анализатора FRET при оптимальных температурных условиях FRET путем количественного определения содержания сахара в коммерчески доступных напитков. Этот протокол обеспечивает детали операции FRET устройства, а также краткое описание датчика и подготовки проб. Мы ожидаем, что этот доклад будет способствовать потенциальное применение портативногоАнализатор в небольших лабораторных условиях и обеспечивают основу для дальнейшего развития недорогого на месте диагностического устройства с биосенсоров FRET основе.

Protocol

1. Приготовление биосенсора Построить плазмиду pET21a (+) – CFP-MBP-YFP-His6 следуя ранее установленным протоколом 2. Инокулируйте 5 мл бульона Луриа (LB) с одной колонии штамма кишечной палочки DE3 и инкубировать при 37 ° С в течение 16 часов при встряхивании. Передача 1 мл / N O к…

Representative Results

Для проведения количественного анализа содержания сахара с использованием анализатора FRET, необходимо построить кривую подогнанную оценки концентрации целевого сахара из наблюдаемого соотношения FRET. Пусть г определить отношение интенсивности излучения УНЧ пр…

Discussion

Этот протокол позволяет быстро и эффективно количественно оценить содержание сахара в образцах напитков, с использованием заказных FRET анализатор 7 при оптимальной температуре для датчиков ладу. Анализатор был разработан с недавно развитой, недорогой 405-нм полоса ультрафиолетов…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Это исследование было поддержано грантами от Intelligent синтетической биологии Центра глобального проекта Frontier (2011-0031944) и Программы KRIBB исследовательской инициативы.

Materials

LB BD #244620
isopropyl β-D-thiogalactoside (IPTG) Sigma I6758
Ampicillin Sigma A9518
Tri-HCl Bioneer C-9006-1
PMSF Sigma 78830
EDTA Bioneer C-9007
DTT Sigma D0632
NaCl Junsei 19015-0350
phosphate-buffered saline (PBS) Gibco 70011-044 0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.0144% Na2HPO4, 0.024% KH2OP4, pH 7.4
SOC 2% tryptone, 0.5% Yeast extract, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MGCl2, 20 mM Glucose
Resource Q Amersham Biosciences 17-1177-01 6 × 30 mm anion-exchange chromatography column 
HisTrap HP1 Amersham Biosciences 29-0510-21
Quartz cuvette Sigma Z802875
AKÄKTAFPLC Amersham Biosciences 18-1900-26 a fast protein liquid chromatography (FPLC)
Cary Eclipse VarianInc a fluorescence spectrophotometer
VICTOR   PerkinElmer 2030-0050 a multilabel plate reader
E. coli JM109 (DE3) Promega Electrocompetent cells
A (Beverage) Korea Yakult Co. (Korea) Birak Fermented drinks
B (Beverage) Lotte Foods (Korea) Epro Soft drink
C (Beverage) Lotte Foods (Korea) Getoray Sports drink

References

  1. Deuschle, K., Okumoto, S., Fehr, M., Looger, L. L., Kozhukh, L., Frommer, W. B. Construction and optimization of a family of genetically encoded metabolite sensors by semirational protein engineering. Protein Sci. 14 (9), 2304-2314 (2005).
  2. Ha, J. S., Song, J. J., Lee, Y. M., Kim, S. J., Sohn, J. H., Shin, C. S., Lee, S. G. Design and application of highly responsive fluorescence resonance energy transfer biosensors for detection of sugar in living Saccharomyces cerevisiae cells. Appl. Environ. Microbiol. 73 (22), 7408-7414 (2007).
  3. Nagai, T., Yamada, S., Tominaga, T., Ichikawa, M., Miyawaki, A. Expanded dynamic range of fluorescent indicators for Ca(2+) by circularly permuted yellow fluorescent proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (29), 10554-10559 (2004).
  4. Okumoto, S., Looger, L. L., Micheva, K. D., Reimer, R. J., Smith, S. J., Frommer, W. B. Detection of glutamate release from neurons by genetically encoded surface-displayed FRET nanosensors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (24), 8740-8745 (2005).
  5. Merzlyakov, M., Li, E., Casas, R., Hristova, K. Spectral Förster resonance energy transfer detection of protein interactions in surface-supported bilayers. Langmuir. 22 (16), 6986-6992 (2006).
  6. Zhang, J., Campbell, R. E., Ting, A. Y., Tsien, R. Y. Creating new fluorescent probes for cell biology. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 3 (12), 906-918 (2002).
  7. Kim, H., Kim, H. S., Ha, J. S., Lee, S. G. A portable FRET analyzer for rapid detection of sugar content. Analyst. 140 (10), 3384-3389 (2015).
  8. Gam, J., Ha, J. -. S., Kim, H., Lee, D. -. H., Lee, J., Lee, S. -. G. Ratiometric analyses at critical temperatures can magnify the signal intensity of FRET-based sugar sensors with periplasmic binding proteins. Biosens. Bioelectron. 72, 37-43 (2015).
  9. Hessels, A. M., Merkx, M. Genetically-encoded FRET-based sensors for monitoring Zn2+ in living cells. Metallomics. 7 (2), 258-266 (2015).
  10. Song, Y., Yang, M., Wegner, S. V., Zhao, J., Zhu, R., Wu, Y., He, C., Chen, P. R. A genetically encoded FRET sensor for intracellular heme. ACS Chem. Biol. 10 (7), 1610-1615 (2015).
  11. . Fluorescent Protein Guide: Biosensors Available from: https://www.addgene.org/fluorescent-proteins/biosensors/ (2015)
  12. Rajendran, R., Rayman, G. Point-of-care blood glucose testing for diabetes care in hospitalized patients: an evidence-based review. J. Diabetes Sci. Technol. 8 (6), 1081-1090 (2014).
  13. Vyas, N. K., Vyas, M. N., Quiocho, F. A. Sugar and signal-transducer binding sites of the Escherichia coli galactose chemoreceptor protein. Science. 242, 1290-1295 (1988).
  14. Leermakers, E. T. M., Felix, J. F., Erler, N. S., Ċerimagić, A., Wijtzes, A. I., Hofman, A., Raat, H., Moll, H. A., Rivadeneira, F., Jaddoe, V. W., Franco, O. H., Kiefte-de Jong, J. C. Sugar-containing beverage intake in toddlers and body composition up to age 6 years: The Generation R Study. Eur. J. Clin. Nutr. 69 (3), 314-321 (2015).
  15. Shilts, M., Styne, D., Drake, C., Aden, C., Townsend, M. Fast food, fat and sugar sweetened beverage items are related to children’s dietary energy density. FASEB J. 29 (1), 731-736 (2015).
  16. Larsson, S. C., Åkesson, A., Wolk, A. Sweetened beverage consumption is associated with increased risk of stroke in women and men. J Nutr. 144 (6), 856-860 (2014).
  17. Melkko, S., Neri, D., Vaillancourt, P. E. Calmodulin as an affinity purification tag. E. coli Gene Expression Protocols. , 69-77 (2003).

Play Video

Cite This Article
Kim, H., Han, G. H., Fu, Y., Gam, J., Lee, S. G. Highly Sensitive and Rapid Fluorescence Detection with a Portable FRET Analyzer. J. Vis. Exp. (116), e54144, doi:10.3791/54144 (2016).

View Video