Síntesis de Proteínas bioconjugados<em> vía</em> Química cisteína-maleimida
Summary
Este protocolo detalla los pasos importantes que se requieren para la bioconjugación de una cisteína que contiene proteína a una maleimida, incluyendo la purificación de reactivos, condiciones de reacción, purificación y caracterización bioconjugado bioconjugado.
Abstract
The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the development of antibody drug conjugates (ADCs) and nanomedicine, fluorescent microscopy and systems chemistry. For many of these applications, specificity of the bioconjugation method used is of prime concern. The Michael addition of maleimides with cysteine(s) on the target proteins is highly selective and proceeds rapidly under mild conditions, making it one of the most popular methods for protein bioconjugation.
We demonstrate here the modification of the only surface-accessible cysteine residue on yeast cytochrome c with a ruthenium(II) bisterpyridine maleimide. The protein bioconjugation is verified by gel electrophoresis and purified by aqueous-based fast protein liquid chromatography in 27% yield of isolated protein material. Structural characterization with MALDI-TOF MS and UV-Vis is then used to verify that the bioconjugation is successful. The protocol shown here is easily applicable to other cysteine – maleimide coupling of proteins to other proteins, dyes, drugs or polymers.
Introduction
La bioconjugación implica la unión covalente de una biomolécula con otra o con una molécula sintética, tal como un tinte, fármaco o un polímero. Métodos bioconjugation proteína ahora se utilizan ampliamente en muchos grupos de investigación química, biología y nanotecnología con aplicaciones que van desde el etiquetado colorante fluorescente 1,2, haciendo de proteína (anticuerpo) -prodrugs 3 (conjugados de fármaco anticuerpo – ADC) síntesis de dímeros de proteína de 4,5 , a través de los híbridos de proteína-polímero auto-montaje de 6,7 utilizadas en nanomedicina 8 y 9 sistemas de la química.
La especificidad de la química utilizada para bioconjugation, aunque no siempre crítico, es de suma importancia para bioconjugados proteína más funcionales, a fin de no interferir con el sitio activo de la proteína diana. La reacción bioconjugation ideales necesita cumplir varios criterios, incluyendo: i) dirigidas a sitios raros o únicos en la proteína de interés,ii) ser selectiva hacia este objetivo, iii) proceda en condiciones no desnaturalizantes para evitar desplegamiento de la proteína y iv) ser de alto rendimiento como la proteína diana es por lo general sólo está disponible a una concentración sub-milimolar. La maleimida – cisteína adición de Michael se acerca a cumplir con todos estos criterios, y tiene por ello reclamó durante mucho tiempo un estatus especial en el campo de la química de bioconjugados 10. Esto se debe a que i) muchas proteínas que contienen residuos sólo una cisteína en su superficie pueden ser modificadas por ingeniería genética allí, ii) en el pH correcto de la reacción es altamente selectiva hacia cisteína, iii) se produce más fácilmente en tampones acuosos y iv) es muy rápido con la segunda constante de velocidad orden de maleimidas a las proteínas que contienen cisteína reportados exceda de 5.000 M -1 s -1 en algunos casos 11. Siempre que la proteína de interés puede tolerar una cantidad pequeña (≈ 5-10%) de co-disolvente orgánico 12, casi cualquier colorante de maleimida-funcionalizado, poLymer, superficie u otra proteína puede estar ligada a las proteínas. Además, maleimidas son más específicos para las cisteínas en proteínas que yodoacetamidas, que son más propensos a reaccionar con otros nucleófilos a pH elevado; y más estable que conjugaciones a base de disulfuro que deben mantenerse a un pH ácido para impedir el intercambio de disulfuro de 13.
Aquí se presenta un protocolo genérico para la conjugación de moléculas de maleimida-funcionalizado para una proteína que contiene un único residuo de cisteína mediante la reacción entre un cromóforo Ru basado en (II) y la proteína citocromo c redox como un ejemplo. Este protocolo es igualmente aplicable a la mayoría de otras proteínas que contienen un residuo de cisteína superficie accesible y el objetivo maleimida-funcionalizado correspondiente, ya sea otra proteína, un colorante fluorescente, un cromóforo o un polímero sintético.
Protocol
Representative Results
Discussion
La purificación de los materiales de partida antes de una bioconjugation es de suma importancia. Las proteínas obtenidas a partir de fuentes recombinantes comerciales contienen a menudo otras isoformas de la proteína de interés, que puede tener diferente química de la superficie y reactividad. Por ejemplo, en la bioconjugación descrito, el cyt c comercialmente disponible contiene una mezcla de ambos cyt c 12,14,17 iso-1 e iso-2. Iso-2 y las formas de citocromo c 1 Iso-son en g…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the Australian Research Council (ARC) for ARC Future Fellowship (FT120100101) and ARC Centre of Excellence CE140100036) grants to P.T. and the Mark Wainwright Analytical Centre at UNSW for access to mass spectrometry and NMR facilities.
Materials
| sodium dihydrogen phosphate | Sigma-Aldrich | 71496 | |
| sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 71691 | |
| sodium chloride | Sigma-Aldrich | 73575 | |
| cytochrome c, from saccaromyces cerevisiae | Sigma-Aldrich | C2436 | |
| dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43819 | |
| TSKgel SP-5PW | Sigma-Aldrich | Tosoh SP-5PW, 07161 | 3.3 mL strong cation exchange column |
| Amicon Ultra-15 | Merck-Millipore | UFC900308 | 3.5 kDa spin filter |
| Slide-A-Lyzer mini dialysis units | Thermo Scientific | 66333 | 3.5 kDa dialysis cassetes |
| Ru(II) bisterpyridine maleimide | Lab made | see ref (14) | |
| acetonitrile | Sigma-Aldrich | A3396 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | 03609 | |
| tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 93284 | |
| imidazole | Sigma-Aldrich | 56749 | |
| nickel acetate | Sigma-Aldrich | 244066 | |
| AcroSep IMAC Hypercell column | Pall | via VWR: 569-1008 | 1 mL IMAC column |
| 0.2 micron cellulose membrane filter | Whatman | Z697958 | 47 mm filter for buffers |
| 0.2 micron PVDF membrane filter | Merck-Millipore | SLGV013SL | syringe filters for proteins |
| hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 84426 | extremely corrosive! Use caution |
| caffeic acid | Sigma-Aldrich | 60018 | MALDI matrix |
| trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | 91707 | extremely corrosive! Use caution |
| SimplyBlue SafeStain | Thermo Scientific | LC6060 | Coomassie blue solution |
| NuPAGE Novex 12% Bis-Tris Gel | Thermo Scientific | NP0342BOX | precast protein gels |
| SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein Standard | Thermo Scientific | LC5925 | premade protein ladder |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | Thermo Scientific | NP0008 | premade gel sample buffer |
| NuPAGE Sample Reducing Agent (10X) | Thermo Scientific | NP0004 | premade gel reducing agent |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer (20X) | Thermo Scientific | NP0002 | premade gel running buffer |
| Voyager DE STR MALDI reflectron TOF MS | Applied Biosystems | ||
| Acta FPLC | GE | Fast Protein Liquid Chromatography | |
| Cary 50 Bio Spectrophotometer | Varian-Agilent | UV-Vis | |
| Milli-Q ultrapure water dispenser | Merck-Millipore | ultrapure water | |
| Low volume UV-Vis Cuvette | Hellma | 105-201-15-40 | 100 microliter cuvette |
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