Synthese von Protein Biokonjugate<em> über</em> Cystein-maleimid Chemie
Summary
Dieses Protokoll beschreibt die wichtigsten Schritte für die Biokonjugation eines Cysteins erforderlich Proteins an ein Maleimid enthalten, einschließlich Reagenz Reinigung, Reaktionsbedingungen Biokonjugat Reinigung und Charakterisierung Biokonjugat.
Abstract
The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the development of antibody drug conjugates (ADCs) and nanomedicine, fluorescent microscopy and systems chemistry. For many of these applications, specificity of the bioconjugation method used is of prime concern. The Michael addition of maleimides with cysteine(s) on the target proteins is highly selective and proceeds rapidly under mild conditions, making it one of the most popular methods for protein bioconjugation.
We demonstrate here the modification of the only surface-accessible cysteine residue on yeast cytochrome c with a ruthenium(II) bisterpyridine maleimide. The protein bioconjugation is verified by gel electrophoresis and purified by aqueous-based fast protein liquid chromatography in 27% yield of isolated protein material. Structural characterization with MALDI-TOF MS and UV-Vis is then used to verify that the bioconjugation is successful. The protocol shown here is easily applicable to other cysteine – maleimide coupling of proteins to other proteins, dyes, drugs or polymers.
Introduction
Biokonjugation beinhaltet die Verknüpfung kovalent ein Biomolekül mit einem anderen oder mit einem synthetischen Molekül, wie ein Farbstoff, Arzneimittel oder einem Polymer. Protein Biokonjugation Methoden werden nun ausführlich in vielen Chemie, Biologie und Nanotechnologie Forschungsgruppen mit Anwendungen , die von fluoreszierenden Farbstoffmarkierung 1,2, Herstellung von Protein (Antikörper) -prodrugs 3 (Antikörper – Wirkstoff – Konjugate – ADCs) verwendet Synthese von Protein – Dimere 4,5 bis hin zu selbstorganisierenden Protein-Polymer – Hybriden 6,7 verwendet in den Bereich Nanomedizin 8 und Systemchemie 9.
Spezifität der Chemie für die Biokonjugation verwendet, während nicht immer kritisch, ist von größter Bedeutung für die meisten funktionellen Protein Biokonjugate, um nicht mit der aktiven Stelle des Zielproteins zu stören. Die ideale Biokonjugation Reaktion muss mehrere Kriterien erfüllen, darunter: i) Targeting seltene oder einzigartige Stellen auf dem Protein von Interesse,ii) werden selektiv in Richtung auf dieses Ziel, iii) gehen unter nicht-denaturierenden Bedingungen Proteins zu vermeiden Entfalten und iv) werden mit hoher Ausbeute als das Zielprotein bei unteratmosphärischem millimolar Konzentration der Regel nur zur Verfügung steht. Das Maleimid – Cystein Michael Zusätzlich kommt in der Nähe , alle diese Kriterien zu erfüllen, und hat aus diesem Grund lange einen besonderen Status im Bereich der Biokonjugat Chemie 10 beansprucht. Dies ist, weil i) viele Proteine nur einen Cysteinrest an ihrer Oberfläche enthalten, können genetisch es so konstruiert werden, ii) in der richtigen pH der Reaktion auf Cystein hochselektiv ist, iii) es verläuft glatt in wässrigen Puffern und iv) es ist sehr schnell mit der Geschwindigkeitskonstante zweiter Ordnung von Maleimiden in Cystein enthaltenden Proteinen berichtet überschreiten 5,000 M -1 sec -1 in einigen Fällen 11. Sofern das Protein von Interesse einen kleinen (≈ 5-10%) Menge an organischem Co-Lösungsmittel 12, fast jede Maleimid-funktionalisierten Farbstoff tolerieren kann, polymer, Oberfläche oder ein anderes Protein können an Proteine gebunden werden. Darüber hinaus sind Maleinimide spezifischer für Cysteine an Proteinen als iodoacetamides, die Reaktion mit anderen Nucleophilen bei erhöhten pH anfälliger sind; und stabiler als Disulfid-basierte Konjugationen , die bei einem sauren pH gehalten werden müssen Disulfidaustausch 13 zu verhindern.
Hier berichten wir über ein generisches Protokoll für die Konjugation von Maleimid-funktionalisierten Molekülen an ein Protein , einen einzelnen Cysteinrest unter Verwendung der Reaktion zwischen einem Ru (II) -Basis Chromophor und dem Redoxprotein Cytochrom c als Beispiel enthalten. Dieses Protokoll ist gleichermaßen auf die meisten anderen Proteine, die eine zugängliche Oberfläche Cysteinrest und das entsprechende Maleimid-funktionalisierten Ziel, sei es ein anderes Protein, ein Fluoreszenzfarbstoff, ein Chromophor oder ein synthetisches Polymer enthält.
Protocol
Representative Results
Discussion
Reinigung der Ausgangsmaterialien vor einer Biokonjugation ist von größter Bedeutung. Proteine, erhalten aus kommerziellen rekombinanten Quellen enthalten oft andere Isoformen des Proteins von Interesse, die unterschiedliche Oberflächenchemie und Reaktivität aufweisen. Beispielsweise in dem beschriebenen Biokonjugation, enthält das handelsübliche cyt c ein Gemisch aus beiden iso-1 und iso-cyt c 2 12,14,17. Iso-2 und iso-1 Formen von Cytochrom c sind weitgehend homolog mit der …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the Australian Research Council (ARC) for ARC Future Fellowship (FT120100101) and ARC Centre of Excellence CE140100036) grants to P.T. and the Mark Wainwright Analytical Centre at UNSW for access to mass spectrometry and NMR facilities.
Materials
| sodium dihydrogen phosphate | Sigma-Aldrich | 71496 | |
| sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 71691 | |
| sodium chloride | Sigma-Aldrich | 73575 | |
| cytochrome c, from saccaromyces cerevisiae | Sigma-Aldrich | C2436 | |
| dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43819 | |
| TSKgel SP-5PW | Sigma-Aldrich | Tosoh SP-5PW, 07161 | 3.3 mL strong cation exchange column |
| Amicon Ultra-15 | Merck-Millipore | UFC900308 | 3.5 kDa spin filter |
| Slide-A-Lyzer mini dialysis units | Thermo Scientific | 66333 | 3.5 kDa dialysis cassetes |
| Ru(II) bisterpyridine maleimide | Lab made | see ref (14) | |
| acetonitrile | Sigma-Aldrich | A3396 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | 03609 | |
| tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 93284 | |
| imidazole | Sigma-Aldrich | 56749 | |
| nickel acetate | Sigma-Aldrich | 244066 | |
| AcroSep IMAC Hypercell column | Pall | via VWR: 569-1008 | 1 mL IMAC column |
| 0.2 micron cellulose membrane filter | Whatman | Z697958 | 47 mm filter for buffers |
| 0.2 micron PVDF membrane filter | Merck-Millipore | SLGV013SL | syringe filters for proteins |
| hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 84426 | extremely corrosive! Use caution |
| caffeic acid | Sigma-Aldrich | 60018 | MALDI matrix |
| trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | 91707 | extremely corrosive! Use caution |
| SimplyBlue SafeStain | Thermo Scientific | LC6060 | Coomassie blue solution |
| NuPAGE Novex 12% Bis-Tris Gel | Thermo Scientific | NP0342BOX | precast protein gels |
| SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein Standard | Thermo Scientific | LC5925 | premade protein ladder |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | Thermo Scientific | NP0008 | premade gel sample buffer |
| NuPAGE Sample Reducing Agent (10X) | Thermo Scientific | NP0004 | premade gel reducing agent |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer (20X) | Thermo Scientific | NP0002 | premade gel running buffer |
| Voyager DE STR MALDI reflectron TOF MS | Applied Biosystems | ||
| Acta FPLC | GE | Fast Protein Liquid Chromatography | |
| Cary 50 Bio Spectrophotometer | Varian-Agilent | UV-Vis | |
| Milli-Q ultrapure water dispenser | Merck-Millipore | ultrapure water | |
| Low volume UV-Vis Cuvette | Hellma | 105-201-15-40 | 100 microliter cuvette |
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