En effektiv metode for å få dedifferensierte fettcellene

Summary

We have modified the conditions for DFAT cell generation and provide herein information regarding the use of an improved growth medium for the production of these cells.

Abstract

Tissue engineering og celleterapi holde store løftet klinisk. I denne forbindelse, kan multipotente celler, slik som stamceller (MSC), anvendes terapeutisk, i nær fremtid, for å gjenopprette funksjon til skadede organer. Likevel, flere tekniske problemer, blant annet den svært invasiv prosedyre for å isolere MSC og ineffektiviteten rundt sin forsterkning, for tiden hemme den potensielle klinisk bruk av disse terapeutiske modaliteter. Heri, innfører vi en svært effektiv metode for generering av dedifferensierte fettceller (DFAT), MSC-lignende celler. Interessant, kan DFAT celler bli differensiert i flere celletyper, inkludert adipogenic, osteogene, og chondrogenic celler. Selv om andre grupper som tidligere har presentert ulike metoder for å generere DFAT celler fra modne fettvev, vår metode tillater oss å produsere DFAT cellene mer effektivt. I denne forbindelse, viser vi at DFAT kulturmedium (DCM), supplert med 20% FBS,er mer effektive i å generere DFAT celler enn DMEM, supplert med 20% FBS. I tillegg kan de DFAT celler som produseres av vår celledyrkningsmetode blir redifferentiated i flere typer vev. Som sådan, er en meget interessant og nyttig modell for studiet av vev dedifferentiation presentert.

Introduction

Celleterapi og tissue engineering er hot tema innen regenerativ medisin ^1-5. Selv om disse terapeutiske modaliteter holde store løftet, flere tekniske problemer for øyeblikket hemme deres klinisk bruk. I denne forbindelse, som i genereringen av iPS celler, må alle vev konstruksjons terapier produsere celler fri for eksterne genet transductions for å opprettholde pasientens sikkerhet. Derved var vi den første gruppen for å kunne produsere menneskelige DFAT celler ^6. Flere andre forskningsgrupper har siden vedtok vår metode for å generere DFAT celler med opphav hos pattedyr ^7-9, ytterligere fremhever nytten av vår modell.

I løpet av flere studier er det funnet at kvaliteten av cellekulturen miljø kan modifiseres ved å justere innholdet av cellemediet. Dette funnet har ført til en økning i suksessrate på DFAT celleproduksjon og forbedret celle kvalitet; både kritiske faktorer ieffektivt generere celler for fremtidige kliniske studier. I denne forbindelse, en forbedret DFAT kulturmedium (DCM, et medium i likhet med mesenchymale stamceller medium, som inneholder rekombinant humant insulin, serum albumin, L-glutaminsyre, flere fettsyrer og kolesterol) og en fremgangsmåte for å DFAT cellegenerering og spredning ble utviklet (mer informasjon om innholdet i DCM er tilgjengelig på forespørsel). Ved hjelp av denne metoden høykvalitets DFAT celler ble samlet med evnen til å differensiere til en rekke celletyper, inkludert adipogenic, osteogene og chondrogenic celler. Til sammen øker dette validert cellekultur protokoll kvaliteten DFAT celler og kan være ganske nyttig for å styrke kliniske anvendelser av celleterapi og tissue engineering.

Protocol

Prøver av menneskelig underhudsfett ble innhentet fra pasienter som gjennomgår kirurgi i Institutt for plastisk kirurgi, urologi, Pediatric Surgery og ortopediske inngrep i Nihon-universitetet Itabashi Hospital (Tokyo, Japan). Pasientene ga skriftlig informert samtykke, og etikkomiteen av Nihon University School of Medicine godkjent studiet. 1. Tissue Forberedelse Ta med vevsprøve fra operasjonsstuen til laboratoriet. Vask 1-2 g fettvev med 5 ml PBS (-) ved romtempera…

Representative Results

I denne studien ble metoden og verktøykasse for DFAT celle generasjon forbedret (Figur 1). Vår metode tillater oss å generere DFAT celler ved hjelp av både DCM og DMEM medium som inneholder 20% FBS (figur 2A). Som sådan, sammenlignet vi effektiviteten av DCM og DMEM i å generere DFAT celler. I denne forbindelse, DCM forbedret DFAT celleproliferasjon med tre ganger sammenlignet med DMEM, uavhengig av antall adipocytter (figur 2A</stron…

Discussion

Modne adipocytter som gjennomgår in vitro dedifferentiation, en prosess som kalles tak kultur, kan gå tilbake til en mer primitiv fenotype og få proliferativ evner. Disse cellene er referert til som dedifferensieres fett (DFAT) celler. Den multilineage differensiering potensialet til DFAT celler ble evaluert. Flow cytometri analyse og genuttrykk analyse viste at DFAT celler var svært homogen i forhold til ASCer ^6. Faktisk er den celle-overflateantigenet profil DFAT celler meget lik dem som finnes…

Materials

CSTI303-MSC medium	CSTI	87-671	This medium is defined as DCM in the text
PBS(-)	Wako	166-23555	It does not contain Mg2+ and Ca2+
DMEM medium	Gibco	11965-092
Fetal Bovine Serum	Sigma	172012
Collagenase type II	Sigma	C-6885
Scissors	Takasago Medical Industry Co., Ltd	TKZ-F2194-1
Shaker	TAITEC	Bioshaker V.BR-36
Falcon Cell Strainer 100um Yellow	CORNING LIFE SCIENCES	DL 352360
Falcon 12.5cm² Rectangular Canted Neck Cell Culture Flask with Blue Vented Screw Cap	CORNING LIFE SCIENCES	353107
18G needle	NIPRO	02-002
20ml Syringe	NIPRO	08-753
Z Series Coulter Counter	BECKMAN COULTER	383550