Summary

Kinetic Medição e visualização em tempo real de Reprogramação Somatic

Published: July 30, 2016
doi:

Summary

O protocolo apresentado no presente estudo descreve métodos para a monitorização em tempo real da progressão reprogramação através da medição da cinética de marcadores de células estaminais pluripotentes positivos e negativos utilizando análise de citometria de fluxo. O protocolo também inclui a avaliação baseada em imagens da morfologia, e marcador ou expressão repórter durante a geração da IPSC.

Abstract

Somatic reprogramming has enabled the conversion of adult cells to induced pluripotent stem cells (iPSC) from diverse genetic backgrounds and disease phenotypes. Recent advances have identified more efficient and safe methods for introduction of reprogramming factors. However, there are few tools to monitor and track the progression of reprogramming. Current methods for monitoring reprogramming rely on the qualitative inspection of morphology or staining with stem cell-specific dyes and antibodies. Tools to dissect the progression of iPSC generation can help better understand the process under different conditions from diverse cell sources.

This study presents key approaches for kinetic measurement of reprogramming progression using flow cytometry as well as real-time monitoring via imaging. To measure the kinetics of reprogramming, flow analysis was performed at discrete time points using antibodies against positive and negative pluripotent stem cell markers. The combination of real-time visualization and flow analysis enables the quantitative study of reprogramming at different stages and provides a more accurate comparison of different systems and methods. Real-time, image-based analysis was used for the continuous monitoring of fibroblasts as they are reprogrammed in a feeder-free medium system. The kinetics of colony formation was measured based on confluence in the phase contrast or fluorescence channels after staining with live alkaline phosphatase dye or antibodies against SSEA4 or TRA-1-60. The results indicated that measurement of confluence provides semi-quantitative metrics to monitor the progression of reprogramming.

Introduction

As células-tronco pluripotentes induzidas derivadas de doentes (iPSCs) são ferramentas promissoras para a terapia celular e triagem de drogas. Eles fornecem uma fonte de células autólogas para terapia. Além disso, elas abrangem um amplo conjunto de origens genéticas, permitindo uma análise detalhada in vitro de doenças genéticas além do que as linhas atuais células-tronco embrionárias (ESC) permitiria. Os avanços recentes levou ao desenvolvimento de vários métodos para gerar iPSCs, incluindo reprogramação com o vírus Sendai, plasmídeos epissomais ou ARNm 1,2. Notavelmente, os diferentes métodos de reprogramação são associados com diferentes níveis de eficiência e segurança, e é provável que diferem de outras formas que influenciam a sua adequação para várias aplicações. Com a disponibilidade de uma variedade de tecnologias de reprogramação, tornou-se importante o desenvolvimento de métodos para avaliar o processo de reprogramação. A maioria dos métodos existentes contam com a inspeção qualitativa da morfologia ou coloraçãocom corantes e anticorpos específicos de células-tronco. Um método recentemente desenvolvido faz uso de repórteres de fluorescência de lentivírus que são sensíveis à miARNs específicos do CPS ou de mRNAs específicos de células diferenciadas 3. Tais métodos de monitorização facilitar a selecção e optimização de técnicas de reprogramação para diferentes situações. Por exemplo, CDy1 foi usado como uma sonda fluorescente para os primeiros iPSCs, a fim de pesquisar moduladores de reprogramação 4. A capacidade de observar e comparar diferentes experiências de reprogramação também é crítico para a obtenção de uma melhor compreensão do próprio processo. Por exemplo, sabe-se agora que alguns tipos de células somáticas são mais fáceis de reprogramar 5 do que outros, e que as células passam por estados intermédios durante a reprogramação 6-8. Infelizmente, os mecanismos subjacentes ao processo de reprogramação ainda não estão completamente esclarecidos e, consequentemente, as diferenças exatas entre métodos de reprogramação também continuam a ser defined. Assim, métodos de monitorização, avaliação e comparação de eventos de reprogramação continuar a ser crítico para o campo das células estaminais.

Os métodos descritos no presente protocolo de permitir a monitorização e a avaliação do processo de reprogramação e ilustram como estas técnicas podem ser usadas para comparar diferentes conjuntos de reagentes de reprogramação. A primeira abordagem envolve a citometria de fluxo analisa utilizando combinações de anticorpos contra células-tronco pluripotentes positivo e negativo (PSC) marcadores. A segunda abordagem pares de imagens em tempo real e a medição da confluência total (área da superfície coberta por cento por as células) e confluência de sinais de marcador (por cento da área de superfície coberta pelos sinais fluorescentes).

Protocol

1.Solution e Médias Preparação Membrana basal da matriz (purificada a partir de Engelbreth-Holm-Swarm tumor) Lentamente descongelar a matriz da membrana basal (5 ml) em gelo a 4 ° C durante a noite. Dilui-se a solução stock de 1: 1 com 5 mL de gelo frio, / meio F-12 DMEM estéril em um, pré-refrigerada tubo de 15 ml estéril. Distribuir aliquotas em pré-refrigerada, tubos de microcentrífuga de 1,5 ml e armazenar estéreis imediatamente a -20 ° C. Antes d…

Representative Results

Monitoramento Kinetics reprogramação utilizando citometria de fluxo CD44 é um marcador de fibroblastos enquanto SSEA4 é um marcador PSC 6,10. Como esperado a partir deste padrão de expressão, a citometria de fluxo de fibroblastos BJ mostra um SSEA4 – CD44 + da população que facilita a criação de portas de quadrante em combinação com a amostra não corado. Durante a reprogra…

Discussion

This study provides strategies for monitoring and tracking of the reprogramming process using flow cytometry and real-time imaging-based analysis. The critical steps in the protocol are initiating reprogramming, measuring reprogramming progression based on marker expression and real-time monitoring of reprogramming. Any reprogramming method of choice can be used but here we focus on Sendai based reprogramming of human fibroblasts. The advantage of this method is the ease of use and consistent high efficiency of reprogram…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores agradecem Chad MacArthur para discussões úteis.

Materials

DMEM, high glucose, GlutaMAXSupplement, pyruvate Thermo Fisher Scientific 10569-010
Fetal Bovine Serum, embryonic stem cell-qualified, US origin Thermo Fisher Scientific 16141-061
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) Thermo Fisher Scientific 11140-050
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red  Thermo Fisher Scientific 25300-054
Mouse (ICR) Inactivated Embryonic Fibroblasts Thermo Fisher Scientific A24903
Attachment Factor Protein (1X) Thermo Fisher Scientific S-006-100
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement Thermo Fisher Scientific 10565-018
KnockOut Serum Replacement Thermo Fisher Scientific 10828010
2-Mercaptoethanol (55 mM) Thermo Fisher Scientific 21985-023
Collagenase, Type IV, powder Thermo Fisher Scientific 17104-019
TrypLE Select Enzyme (1X), no phenol red  Thermo Fisher Scientific 12563-011
DPBS, no calcium, no magnesium  Thermo Fisher Scientific 14190-144
Geltrex LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix Thermo Fisher Scientific A1413302
Essential 8 Medium Thermo Fisher Scientific A1517001
FGF-Basic (AA 1-155) Recombinant Human Protein Thermo Fisher Scientific PHG0264
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 Thermo Fisher Scientific 15575-020
Bovine Albumin Fraction V (7.5% solution) Thermo Fisher Scientific 15260-037
HEPES (1 M) Thermo Fisher Scientific 15630-080
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Fisher Scientific 15140-122
InSolution Y-27632 EMD Millipore 688001
CytoTune-iPS Sendai Reprogramming Kit Thermo Fisher Scientific A1378001
CytoTune-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit Thermo Fisher Scientific A16517
Countess II Automated Cell Counter Thermo Fisher Scientific AMQAX1000
Countess Cell Counting Chamber Slides Thermo Fisher Scientific C10228
BJ ATCC Human Foreskin Fibroblasts, Neonatal ATCC CRL-2522
DF1 Adult Human Dermal Fibroblast Thermo Fisher Scientific N/A
BG01V/hOG Cells Variant hESC hOct4-GFP Reporter Cells Thermo Fisher Scientific R7799-105
IncuCyte ZOOM Essen BioScience
SSEA-4 Antibody, Alexa Fluor 647 conjugate (MC813-70) Thermo Fisher Scientific SSEA421
SSEA-4 Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate (eBioMC-813-70 (MC-813-70)) Thermo Fisher Scientific A14810
SSEA-4 Antibody (MC813-70) Thermo Fisher Scientific 41-4000
TRA-1-60 Antibody (cl.A) Thermo Fisher Scientific  41-1000
CD44 Rat Anti-Human/Mouse mAb (clone IM7), PE-Cy5 conjugate Thermo Fisher Scientific A27094
CD44 Alexa Fluor 488 Conjugate Kit for Live Cell Imaging Thermo Fisher Scientific A25528
CD44 Rat Anti-Human/Mouse mAb (Clone IM7) Thermo Fisher Scientific RM-5700 (no longer available)
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate Thermo Fisher Scientific  A-11029
Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate Thermo Fisher Scientific  A-11007
Alkaline Phosphatase Live Stain Thermo Fisher Scientific A14353
TRA-1-60 Alexa Fluor 488 Conjugate Kit for Live Cell Imaging Thermo Fisher Scientific A25618
CD24 Mouse Anti-Human mAb (clone SN3), FITC conjugate Thermo Fisher Scientific MHCD2401
beta-2 Microglobulin Antibody, FITC conjugate (B2M-01) Thermo Fisher Scientific A15737
EpCAM / CD326 Antibody, FITC conjugate (VU-1D9) Thermo Fisher Scientific A15755
CD73 / NT5E Antibody (7G2) Thermo Fisher Scientific 41-0200
VECTOR Red Alkaline Phosphatase (AP) Substrate Kit Vector Laboratories SK-5100
Zeiss Axio Observer.Z1 microscope  Carl Zeiss 491912-0003-000
FlowJo Data Analysis Software FLOJO, LLC N/A
Attune Accoustic Focusing Cytometer, Blue/Red Laser Thermo Fisher Scientific Use Attune NXT 
S3e Cell Sorter (488/561 nm) BIO-RAD 1451006
Falcon 12 x 75 mm Tube with Cell Strainer Cap Corning 352235
Falcon 15 mL, high-clarity, dome-seal screw cap Corning 352097
Falcon T-75 Flask Corning 353136
Falcon T-175 Flask Corning 353112
Falcon 6-well dish Corning 353046
HERAEUS HERACELL CO2 ROLLING INCUBATOR Thermo Fisher Scientific 51013669
Nonstick, RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL AM12450
HulaMixer Sample Mixer 15920D

References

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Cite This Article
Quintanilla Jr., R. H., Asprer, J., Sylakowski, K., Lakshmipathy, U. Kinetic Measurement and Real Time Visualization of Somatic Reprogramming. J. Vis. Exp. (113), e54190, doi:10.3791/54190 (2016).

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