Retroviral התמרה של ובתאים מח עצם כדי ליצור תאי T קולטן Retrogenic עכברים
Summary
We present a rapid and flexible protocol for a single T cell receptor (TCR) retroviral-based in vivo expression system. Retroviral vectors are used to transduce bone marrow progenitor cells to study T cell development and function of a single TCR in vivo as an alternative to TCR transgenic mice.
Abstract
T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively. The vast array of TCRs proves studying a specific antigenic response difficult. Therefore, TCR transgenic mice were made to study positive and negative selection in the thymus as well as peripheral T cell activation, proliferation and tolerance. However, relatively few TCR transgenic mice have been generated specific to any given antigen. Thus, studies involving TCRs of varying affinities for the same antigenic peptide have been lacking. The generation of a new TCR transgenic line can take six or more months. Additionally, any specific backcrosses can take an additional six months. In order to allow faster generation and screening of multiple TCRs, a protocol for retroviral transduction of bone marrow was established with stoichiometric expression of the TCRα and TCRβ chains and the generation of retrogenic mice. Each retrogenic mouse is essentially a founder, virtually negating a founder effect, while the length of time to generate a TCR retrogenic is cut from six months to approximately six weeks. Here we present a rapid and flexible alternative to TCR transgenic mice that can be expressed on any chosen background with any particular TCR.
Introduction
קולטן תא T (TCR) הרפרטואר של בני אדם ועכברים כבר נאמד ב 1 x 10 8 ו -2 x 10 6 TCRs ייחודי בהתאמה 1,2. מגוון גדול זה מאפשר לתאי T להכיר מגוון רחב של אפיטופים אנטיגן נגזרו-פפטידים עצמיים וכן פתוגנים שהציג מורכבי histocompatibility הגדולים (MHC) על תאי מציגי אנטיגן (נגמ"שים). ההבדלים הדקים האינטראקציות של TCRs עם מתחמים ייחודיים פפטיד-MHC להכתיב אם תא T יעבור אפופטוזיס, anergy, הפעלה, בידול, ייצור ציטוקינים או רעיל. עם זאת, בשל רפרטואר TCR הגדול, ולנתח את ההשפעה של ספציפיות TCR יגיב אנטיגן מסוים מחייב שימוש יחיד מערכות TCR.
עכברים מהונדסים TCR שונים נוצרו על מנת ללמוד את הפונקציה של יחיד TCR במודל vivo ב 3-9. עם זאת, יש מספר אזהרות בנוגע TCR עכברים מהונדסים כוללעלות, את משך הזמן כדי ליצור עכבר מהונדס יחיד והשפעת המייסד שנקראת החדרת transgene האקראית לתוך ה- DNA germline 10. לכן, רק מעטים יחסית עכברים מהונדסים TCR נוצרו עבור כל אנטיגן נתון ואת ההשלכות הפונקציונליות של זיקת TCR גבוהה ונמוכה עבור אותו אפיטופ לעתים רחוקות מופנות. כדי לענות על הצורך בגישה מהירה למסך וללמוד מרובי TCRs בנפרד או במשולב, retrogenic ( 'רטרו' מ רטרו-וירוס ו 'genic' מ מהונדס) עכברים כבר נוצל כחלופת TCR עכברים מהונדסים 11-13.
מוטיב קונסנסוס פפטיד 2A נמצא בתוך כמה וירוסים מורכב 2A-Asp-Val / Ile-השפע-X-ASN-פרו-גלאי-2B-פרו, שבה מחשוף מתרחש בין גליצין של 2A ואת פרולין של 2B מפעילות hydrolase -acting ציס, וכתוצאה מכך מדלגים ריבוזומלי במהלך התרגום 10,14-16. לקבלת דיאגרמה מפורטת המתארת את גleavage של פפטידים 2A שונים (F2A, E2A, T2a ו P2A) עיין אזכור 10 – 12. באופן זה, 2 cistrons (אלפא ובטא TCR TCR) ניתן לקשר וכתוצאה מכך תרגום stoichiometric ב וקטור יחיד. ניצול גישה זו, אנו מסוגלים לבטא ישירות להשוות TCRs אנטיגן ספציפי מרובים in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
בפרוטוקול, אנו שלבים קריטיים מספר בפירוט כדי להבטיח בריאות מח עצם אופטימלית, יעילות תמרה והרכבתה מחדש. השלב הקריטי הראשון הוא הדור ותחזוקה ראויה של תאים המפיק ויראלי GP + E86. השתמש שורות תאי מפיק פרקים מוקדמות ולשמור על 80% confluency או נמוך לפני שימוש. בעת ביצוע תאים טריים מ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מ- NIH (5K22A1119151-01 ו 1R56DK104903-01) כדי MLB, תוכנית פיילוט / היתכנות של המכון לחקר סכרת (P30-DK079638) ב BCM, JDRF 1-FAC-2014-243-AN APF, ADA 1-15-JF-07, קריירה AAI באימונולוגיה אחוות כדי מגה, רוברט וג'ניס מקניר קרן.
Materials
| DMEM, high glucose + glutamine | Corning Cellgro | 10-013-CV | Dulbecco's Modification of Eagle's Medium with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate |
| FBS | Atlanta Biological | S11550 | |
| Trypsin-Versene | Lonza | 17-161F | |
| 0.45 um syringe filter | Thermo Scientific | 194-2545 | |
| polybrene | Sigma | H9268-10G | Sterile Filtered in dH2O |
| Ciprofloxacin | VWR | AAJ61970-06 | |
| 5-fluorouracil (5-FU) | VWR | AAA13456-06 | |
| Sodium Pyruvate | Corning Cellgro | 25-000-CI | |
| MEM nonessential Amino Acids | Corning Cellgro | 25-025-CI | |
| HEPES 1M solution | Corning Cellgro | 25-060-CI | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco by Life Technologies | 21985-023 | |
| Pen/Strept | Corning Cellgro | 30-002-CI | |
| L-glutamine | Corning Cellgro | 25-005-CI | |
| 150 mm tissue culture dishes | Greiner Bio-one | 639160 | |
| Tisue culture-treated 6-well flat plate | Greiner Bio-one | 657160 | |
| 70 um nylon cell strainers | Falcon | 352350 | |
| Mouse IL-3 | Invitrogen | PMC0033 | |
| Human IL-6 | Invitrogen | PHC0063 | |
| Mouse Stem Cell Factor | Invitrogen | PMC2113L | |
| 10x PBS | Corning Cellgro | 46-D13-CM | |
| HANKS Buffer | Corning Cellgro | 21020147 | |
| BD 10 mL Syringe | BD | 300912 | |
| BD 1 mL Syringe | BD | 309659 | |
| 27G x 1/2 BD Precision Glide Needle | BD | 305109 | |
| 30G x 1/2 BD Precision Glide Needle | BD | 305106 |
References
- Qi, Q., et al. Diversity and clonal selection in the human T-cell repertoire. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 13139-13144 (2014).
- Zarnitsyna, V. I., Evavold, B. D., Schoettle, L. N., Blattman, J. N., Antia, R. Estimating the diversity, completeness, and cross-reactivity of the T cell repertoire. Frontiers in immunology. 4, 485 (2013).
- Kisielow, P., Bluthmann, H., Staerz, U. D., Steinmetz, M., von Boehmer, H. Tolerance in T-cell-receptor transgenic mice involves deletion of nonmature CD4+8+ thymocytes. Nature. 333, 742-746 (1988).
- Hogquist, K. A., et al. T cell receptor antagonist peptides induce positive selection. Cell. 76, 17-27 (1994).
- Verdaguer, J., et al. Spontaneous autoimmune diabetes in monoclonal T cell nonobese diabetic mice. J Exp Med. 186, 1663-1676 (1997).
- Katz, J. D., Wang, B., Haskins, K., Benoist, C., Mathis, D. Following a diabetogenic T cell from genesis through pathogenesis. Cell. 74, 1089-1100 (1993).
- Pauza, M. E., et al. T-cell receptor transgenic response to an endogenous polymorphic autoantigen determines susceptibility to diabetes. Diabetes. 53, 978-988 (2004).
- Jasinski, J. M., et al. Transgenic insulin (B:9-23) T-cell receptor mice develop autoimmune diabetes dependent upon RAG genotype, H-2g7 homozygosity, and insulin 2 gene knockout. Diabetes. 55, 1978-1984 (2006).
- Kersh, G. J., et al. TCR transgenic mice in which usage of transgenic alpha- and beta-chains is highly dependent on the level of selecting ligand. Journal of immunology. 161, 585-593 (1998).
- Bettini, M. L., Bettini, M., Vignali, D. A. TCR retrogenic mice: A rapid, flexible alternative to TCR transgenic mice. Immunology. 136 (3), 265-272 (2012).
- Holst, J., et al. Generation of T-cell receptor retrogenic mice. Nat Protoc. 1, 406-417 (2006).
- Holst, J., Vignali, K. M., Burton, A. R., Vignali, D. A. Rapid analysis of T-cell selection in vivo using T cell-receptor retrogenic mice. Nat Methods. 3, 191-197 (2006).
- Bettini, M. L., Bettini, M., Nakayama, M., Guy, C. S., Vignali, D. A. Generation of T cell receptor-retrogenic mice: improved retroviral-mediated stem cell gene transfer. Nat Protoc. 8, 1837-1840 (2013).
- Donnelly, M. L., et al. Analysis of the aphthovirus 2A/2B polyprotein ‘cleavage’ mechanism indicates not a proteolytic reaction, but a novel translational effect: a putative ribosomal ‘skip’. J Gen Virol. 82, 1013-1025 (2001).
- Atkins, J. F., et al. A case for “StopGo”: reprogramming translation to augment codon meaning of GGN by promoting unconventional termination (Stop) after addition of glycine and then allowing continued translation (Go). RNA. 13, 803-810 (2007).
- Doronina, V. A., et al. Site-specific release of nascent chains from ribosomes at a sense codon. Mol Cell Biol. 28, 4227-4239 (2008).
- Bettini, M., et al. TCR affinity and tolerance mechanisms converge to shape T cell diabetogenic potential. Journal of immunology. 193, 571-579 (2014).
- Brehm, M. A., Wiles, M. V., Greiner, D. L., Shultz, L. D. Generation of improved humanized mouse models for human infectious diseases. J Immunol Methods. 410, 3-17 (2014).
- Brehm, M. A., Shultz, L. D., Greiner, D. L. Humanized mouse models to study human diseases. Curr Opin Endocrinol Diabetes Obes. 17, 120-125 (2010).
- Chaplin, P. J., et al. Production of interleukin-12 as a self-processing 2A polypeptide. J Interferon Cytokine Res. 19, 235-241 (1999).
- Collison, L. W., et al. The inhibitory cytokine IL-35 contributes to regulatory T-cell function. Nature. 450, 566-569 (2007).
- Holst, J., et al. Scalable signaling mediated by T cell antigen receptor-CD3 ITAMs ensures effective negative selection and prevents autoimmunity. Nature immunology. 9, 658-666 (2008).
- Kalos, M., et al. T cells with chimeric antigen receptors have potent antitumor effects and can establish memory in patients with advanced leukemia. Sci Transl Med. 3, 95ra73 (2011).
- VanSeggelen, H., et al. T Cells Engineered With Chimeric Antigen Receptors Targeting NKG2D Ligands Display Lethal Toxicity in Mice. Mol Ther. 23, 1600-1610 (2015).
