Retroviral transducción de células progenitoras de médula ósea para generar las células T del receptor Retrogenic ratones
Summary
We present a rapid and flexible protocol for a single T cell receptor (TCR) retroviral-based in vivo expression system. Retroviral vectors are used to transduce bone marrow progenitor cells to study T cell development and function of a single TCR in vivo as an alternative to TCR transgenic mice.
Abstract
T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively. The vast array of TCRs proves studying a specific antigenic response difficult. Therefore, TCR transgenic mice were made to study positive and negative selection in the thymus as well as peripheral T cell activation, proliferation and tolerance. However, relatively few TCR transgenic mice have been generated specific to any given antigen. Thus, studies involving TCRs of varying affinities for the same antigenic peptide have been lacking. The generation of a new TCR transgenic line can take six or more months. Additionally, any specific backcrosses can take an additional six months. In order to allow faster generation and screening of multiple TCRs, a protocol for retroviral transduction of bone marrow was established with stoichiometric expression of the TCRα and TCRβ chains and the generation of retrogenic mice. Each retrogenic mouse is essentially a founder, virtually negating a founder effect, while the length of time to generate a TCR retrogenic is cut from six months to approximately six weeks. Here we present a rapid and flexible alternative to TCR transgenic mice that can be expressed on any chosen background with any particular TCR.
Introduction
Receptor de células T (TCR) repertorio de los seres humanos y los ratones se ha estimado en 1 x 10 8 y 2 x 10 6 TCR únicos respectivamente 1,2. Esta gran diversidad permite a las células T para reconocer una amplia gama de epítopos de antígenos derivados de péptidos propios, así como de los agentes patógenos presentados por el complejo principal de histocompatibilidad (MHC) sobre las células presentadoras de antígeno (APCs). Las diferencias sutiles en las interacciones de los TCR con los complejos de péptido-MHC únicas dictan si una célula T se someterá a la apoptosis, anergia, activación, diferenciación, la producción de citoquinas o la citotoxicidad. Sin embargo, debido a la gran repertorio TCR, el análisis de cómo un TCR específico responderá a un antígeno particular requiere el uso de los sistemas individuales de TCR.
Varios ratones transgénicos TCR se han generado con el fin de estudiar la función de un único TCR en un modelo in vivo 3-9. Sin embargo, hay advertencias a TCR ratones transgénicos incluyendo elcosto, la longitud de tiempo para generar un solo ratón transgénico y el llamado efecto fundador de inserción del transgén en el ADN de la línea germinal azar 10. Por lo tanto, son relativamente pocos los ratones transgénicos TCR se han generado para cualquier antígeno dado y las implicaciones funcionales de alta y baja afinidad TCR para el mismo epítopo rara vez se abordan. Para hacer frente a la necesidad de un acercamiento rápido a la pantalla y estudiar múltiples TCR de forma individual o en combinación, los ratones retrogenic ( 'retro' del retrovirus y 'génicas "de transgénicos) se han utilizado como una alternativa a la TCR ratones transgénicos 11-13.
El motivo de consenso péptido 2A se encuentra dentro de varios virus se componen de una 2A-Asp-Val / Ile-GLUT-X-Asn-Pro-Gly-2B-Pro, en la que la escisión se produce entre la glicina de la 2A y de la prolina de la 2B a partir de cis-actuando hidrolasa actividad, lo que resulta en la omisión del ribosoma durante la traducción 10,14-16. Para un diagrama detallado que representa la cleavage de los diversos péptidos 2A (F2A, E2A, T2A y P2A), consulte las referencias 10 – 12. De esta manera, 2 cistrones (TCR alfa y beta TCR) se pueden vincular resultando en la traducción estequiométrica en un solo vector. Utilizando este enfoque, somos capaces de expresar y comparar directamente los múltiples TCR específicos de antígeno in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
En el protocolo, detallamos varios pasos críticos para garantizar la salud de la médula ósea óptima, la eficacia de transducción y reconstitución. Primer paso fundamental es la generación y el mantenimiento adecuado de las células productoras viral GP + E86. Utilice líneas celulares productoras de paso de los primeros y mantener a 80% de confluencia o inferior antes de su uso. Al hacer células productoras viral GP + E86 frescos, asegurarse de que las células 293T son principios de paso y creciendo en cultivo …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por subvenciones del NIH (5K22A1119151-01 y 1R56DK104903-01) a MLB, Programa Piloto / Viabilidad del Centro de Investigación de la Diabetes (P30-DK079638) en BCM, JDRF 1-FAC-2014-243-un APF, ADA 1-15-JF-07, Carreras AAI en Inmunología Beca de MB y La Fundación Robert y Janice McNair.
Materials
| DMEM, high glucose + glutamine | Corning Cellgro | 10-013-CV | Dulbecco's Modification of Eagle's Medium with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate |
| FBS | Atlanta Biological | S11550 | |
| Trypsin-Versene | Lonza | 17-161F | |
| 0.45 um syringe filter | Thermo Scientific | 194-2545 | |
| polybrene | Sigma | H9268-10G | Sterile Filtered in dH2O |
| Ciprofloxacin | VWR | AAJ61970-06 | |
| 5-fluorouracil (5-FU) | VWR | AAA13456-06 | |
| Sodium Pyruvate | Corning Cellgro | 25-000-CI | |
| MEM nonessential Amino Acids | Corning Cellgro | 25-025-CI | |
| HEPES 1M solution | Corning Cellgro | 25-060-CI | |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco by Life Technologies | 21985-023 | |
| Pen/Strept | Corning Cellgro | 30-002-CI | |
| L-glutamine | Corning Cellgro | 25-005-CI | |
| 150 mm tissue culture dishes | Greiner Bio-one | 639160 | |
| Tisue culture-treated 6-well flat plate | Greiner Bio-one | 657160 | |
| 70 um nylon cell strainers | Falcon | 352350 | |
| Mouse IL-3 | Invitrogen | PMC0033 | |
| Human IL-6 | Invitrogen | PHC0063 | |
| Mouse Stem Cell Factor | Invitrogen | PMC2113L | |
| 10x PBS | Corning Cellgro | 46-D13-CM | |
| HANKS Buffer | Corning Cellgro | 21020147 | |
| BD 10 mL Syringe | BD | 300912 | |
| BD 1 mL Syringe | BD | 309659 | |
| 27G x 1/2 BD Precision Glide Needle | BD | 305109 | |
| 30G x 1/2 BD Precision Glide Needle | BD | 305106 |
References
- Qi, Q., et al. Diversity and clonal selection in the human T-cell repertoire. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 13139-13144 (2014).
- Zarnitsyna, V. I., Evavold, B. D., Schoettle, L. N., Blattman, J. N., Antia, R. Estimating the diversity, completeness, and cross-reactivity of the T cell repertoire. Frontiers in immunology. 4, 485 (2013).
- Kisielow, P., Bluthmann, H., Staerz, U. D., Steinmetz, M., von Boehmer, H. Tolerance in T-cell-receptor transgenic mice involves deletion of nonmature CD4+8+ thymocytes. Nature. 333, 742-746 (1988).
- Hogquist, K. A., et al. T cell receptor antagonist peptides induce positive selection. Cell. 76, 17-27 (1994).
- Verdaguer, J., et al. Spontaneous autoimmune diabetes in monoclonal T cell nonobese diabetic mice. J Exp Med. 186, 1663-1676 (1997).
- Katz, J. D., Wang, B., Haskins, K., Benoist, C., Mathis, D. Following a diabetogenic T cell from genesis through pathogenesis. Cell. 74, 1089-1100 (1993).
- Pauza, M. E., et al. T-cell receptor transgenic response to an endogenous polymorphic autoantigen determines susceptibility to diabetes. Diabetes. 53, 978-988 (2004).
- Jasinski, J. M., et al. Transgenic insulin (B:9-23) T-cell receptor mice develop autoimmune diabetes dependent upon RAG genotype, H-2g7 homozygosity, and insulin 2 gene knockout. Diabetes. 55, 1978-1984 (2006).
- Kersh, G. J., et al. TCR transgenic mice in which usage of transgenic alpha- and beta-chains is highly dependent on the level of selecting ligand. Journal of immunology. 161, 585-593 (1998).
- Bettini, M. L., Bettini, M., Vignali, D. A. TCR retrogenic mice: A rapid, flexible alternative to TCR transgenic mice. Immunology. 136 (3), 265-272 (2012).
- Holst, J., et al. Generation of T-cell receptor retrogenic mice. Nat Protoc. 1, 406-417 (2006).
- Holst, J., Vignali, K. M., Burton, A. R., Vignali, D. A. Rapid analysis of T-cell selection in vivo using T cell-receptor retrogenic mice. Nat Methods. 3, 191-197 (2006).
- Bettini, M. L., Bettini, M., Nakayama, M., Guy, C. S., Vignali, D. A. Generation of T cell receptor-retrogenic mice: improved retroviral-mediated stem cell gene transfer. Nat Protoc. 8, 1837-1840 (2013).
- Donnelly, M. L., et al. Analysis of the aphthovirus 2A/2B polyprotein ‘cleavage’ mechanism indicates not a proteolytic reaction, but a novel translational effect: a putative ribosomal ‘skip’. J Gen Virol. 82, 1013-1025 (2001).
- Atkins, J. F., et al. A case for “StopGo”: reprogramming translation to augment codon meaning of GGN by promoting unconventional termination (Stop) after addition of glycine and then allowing continued translation (Go). RNA. 13, 803-810 (2007).
- Doronina, V. A., et al. Site-specific release of nascent chains from ribosomes at a sense codon. Mol Cell Biol. 28, 4227-4239 (2008).
- Bettini, M., et al. TCR affinity and tolerance mechanisms converge to shape T cell diabetogenic potential. Journal of immunology. 193, 571-579 (2014).
- Brehm, M. A., Wiles, M. V., Greiner, D. L., Shultz, L. D. Generation of improved humanized mouse models for human infectious diseases. J Immunol Methods. 410, 3-17 (2014).
- Brehm, M. A., Shultz, L. D., Greiner, D. L. Humanized mouse models to study human diseases. Curr Opin Endocrinol Diabetes Obes. 17, 120-125 (2010).
- Chaplin, P. J., et al. Production of interleukin-12 as a self-processing 2A polypeptide. J Interferon Cytokine Res. 19, 235-241 (1999).
- Collison, L. W., et al. The inhibitory cytokine IL-35 contributes to regulatory T-cell function. Nature. 450, 566-569 (2007).
- Holst, J., et al. Scalable signaling mediated by T cell antigen receptor-CD3 ITAMs ensures effective negative selection and prevents autoimmunity. Nature immunology. 9, 658-666 (2008).
- Kalos, M., et al. T cells with chimeric antigen receptors have potent antitumor effects and can establish memory in patients with advanced leukemia. Sci Transl Med. 3, 95ra73 (2011).
- VanSeggelen, H., et al. T Cells Engineered With Chimeric Antigen Receptors Targeting NKG2D Ligands Display Lethal Toxicity in Mice. Mol Ther. 23, 1600-1610 (2015).
