Rapid high-throughput Specie Identificazione del materiale botanico Utilizzando l'analisi diretta in tempo reale ad alta risoluzione Spettrometria di Massa

Summary

Un metodo per l'identificazione delle specie di materiale botanico mediante l'analisi diretta nel settore della spettrometria di massa risoluzione tempo-alta e l'analisi statistica multivariata è presentato.

Abstract

Abbiamo dimostrato che l'analisi diretta nel settore della spettrometria di massa risoluzione tempo-alta può essere utilizzata per la produzione di profili di massa spettrali del materiale botanico, e che queste impronte digitali chimiche possono essere utilizzati per l'identificazione delle specie vegetali. I dati spettrali di massa possono essere acquisiti rapidamente e in modo high throughput senza necessità di estrazione del campione, derivatizzazione o regolazione pH passi. L'uso di questa tecnica bypassa le sfide presentate da tecniche più convenzionali, tra cui tempi di analisi lunghi cromatografiche e metodi intensivi di risorse. Le capacità di throughput elevati dell'analisi diretta in tempo reale ad alta risoluzione protocollo spettrometria di massa, insieme con multivariata elaborazione dell'analisi statistica dei dati, forniscono non solo classe caratterizzazione delle piante, ma anche produrre le specie e le informazioni varietale. Qui, la tecnica è dimostrato con due prodotti psicoattivi vegetali, Mitragyna speciosa (kratom) e Datura(Jimsonweed), che sono stati sottoposti ad analisi diretta in real spettrometria di massa risoluzione temporale elevata seguita da trasformazione analisi statistica dei dati spettrali di massa. L'applicazione di questi strumenti in tandem abilitare i materiali vegetali la rapida identificazione a livello di varietà e specie.

Introduction

Per millenni, i prodotti naturali psicoattive sono stati utilizzati nei rituali sciamanici, abusati per i loro attributi che alterano la mente, e consumato per le loro proprietà medicinali. L'ingestione di queste piante e le relative sostanze di origine vegetale può essere significativo nelle zone dove sono endemiche, e hanno importanza sociale ed economica. Recentemente, tuttavia, c'è stato un drammatico aumento l'uso di questi farmaci "naturali" a causa della facilità di accesso attraverso il commercio internet. La percezione che queste sostanze sono sicuri da usare, accoppiato con un aumento del giro di vite sul possesso e l'uso di droghe più tradizionali di abuso e sostanze sintetiche, hanno contribuito al picco di abuso di farmaci a base vegetale. È generalmente difficile da visualizzazione distinguere tra questi prodotti e materiale vegetale innocua, e quindi vi è interesse nello sviluppo di metodi che possono essere utilizzati identificare questi prodotti. Tuttavia, i metodi di analisi convenzionali per impiantil'identificazione delle specie sono molto tempo e poco pratico da eseguire. Inoltre, il processo di sviluppo metodi è tempo e risorse. Questi fattori hanno reso la lavorazione di una legislazione per limitare l'uso di queste sostanze molto indietro il tasso di escalation nella loro abuso. Quindi, ci sono poche leggi che regolano la produzione, la fabbricazione, la vendita e il consumo di molti di questi psicoattivi naturali e, come tale, ci sono centinaia di piante di abusi a disposizione degli utenti in migliaia di forme diverse. ^1,2

Due di questi farmaci a base di piante di abuso sono Mitragyna speciosa, comunemente conosciuto come kratom, e le piante dal genere Datura, vale a dire D. stramonium, D. ferox e D. inoxia. kratom e Datura sono in programma negli Stati Uniti, ma la Drug Enforcement Administration ha elencato sia come farmaci di preoccupazione. ^3,4 kratom è caratterizzato dalla presenza dei composti psicoattivi mitraginina unND 7-hydroxymitragynine, così come altri alcaloidi psicoattivi non compreso mitraphylline, paynantheine, corynoxeine, e rhynchophylline. ^4-8 Le proprietà psicoattive di Datura spp. sono attribuiti a atropina e scopolamina, ma una varietà di altri alcaloidi tropanici sono state identificate nelle piante. ^9-12 Sia kratom e Datura sono stati implicati in casi di avvelenamento e di decessi, e la loro identificazione è sempre più necessaria in entrambi i contesti forensi e tossicologiche, come l'abuso di questi prodotti è in aumento. ^13-16

In generale, i metodi tradizionali utilizzati per l'analisi dei materiali di droga legale, come i test dei colori, la microscopia, e Raman e spettroscopia infrarossa, sono utilizzati in una regola-in / regola-out capacità presuntiva. tecniche combinate quali GC-MS e spettrometria di cromatografia-massa liquida (LC-MS), sono metodi di analisi di conferma basate sul confronto dei profili di analiti rilevatial gruppo di lavoro scientifico per l'analisi della droga sequestrata (SWGDRUG) standard di libreria. ¹⁷ Le fasi di trattamento del campione che vengono eseguite prima dell'analisi, tra cui la polverizzazione, l'estrazione, derivatizzazione e l'evaporazione, può aggiungere ore per il tempo di esecuzione e adulterate il campione, ^{9,11 , 18,19} rendere l'analisi dei prodotti erboristici meno semplice rispetto a quello di altri farmaci tradizionali di abuso come la cocaina o eroina. Inoltre, i singoli programmi cromatografici devono essere sviluppati per ogni prodotto di interesse, che rende l'implementazione di protocolli operativi standard per ogni specie o varietà di farmaci a base di piante di abuso altamente impraticabile per attività operative di routine.

Analisi diretta nel settore della spettrometria di massa risoluzione tempo-alta è una tecnica di spettrometria di massa a ionizzazione ambiente che aggira alcune delle sfide connesse con metodi analitici convenzionali. Gas, liquidi, solidi, polveri, piastre TLC ed impianti material possono tutti essere analizzati direttamente mediante analisi diretta in tempo reale ad alta risoluzione spettrometria di massa, e composti sia polari e non polari può essere facilmente individuata in matrici complesse. ^20-22 Inoltre, studi hanno dimostrato che i composti psicoattivi possono identificare rapidamente materiale vegetale mediante l'analisi diretta nel settore della spettrometria di massa risoluzione tempo-alta, e le informazioni specifiche specie può essere raccolte da trattamento statistico dei dati spettrali di massa. ^22-26

Qui, dimostriamo che l'analisi diretta nel settore della spettrometria di massa risoluzione tempo-alta può essere utilizzato per valutare rapidamente vari materiali vegetali (ad esempio, piante, polveri, estratti alimentari e semi) per i loro componenti psicoattivi, e che le specie e le varietà della pianta- prodotti derivati ​​possono essere determinati in modo rapido e high-throughput. L'analisi del materiale botanico forense rilevanti, senza bisogno di fasi di preparazione del campione o lungo cromatograficatempi di esecuzione di analisi, oltre all'identificazione delle specie vegetali è riportato.

Protocol

1. Preparazione del materiale vegetale Kratom fresco materiale fogliare Utilizzare da 6 mm di diametro del foro del punzone per creare chads uniformi di kratom materiale fogliare da M. impianto speciosa. Ripetere 5 volte. Kratom Polvere di estrazione Mescolare 5 ml di etanolo e 5 ml di acqua distillata per creare 1: 1 miscela solvente per l'estrazione. In una provetta da 1,5 ml, sospendere una piccola quantità (~ 5 mg) di Kratom Bali polvere in 1 ml di 1: 1 EtOH: H 2 O miscela solvente. Ripetere 5 volte. Sonicare i campioni di estratto in polvere di Bali kratom in un bagno ad ultrasuoni per 30 minuti a temperatura ambiente. Centrifugare i campioni di estratto in polvere kratom Bali per 2 min a 750 xg a temperatura ambiente. Decantare il solvente dalla polvere residua per la successiva analisi. Preparazione delle sementi Datura Tagliate un D. stramseme onio metà di tutti i piano trasversale con una lama di rasoio. Ripetere con 5 diversi semi. Ripetere l'operazione per D. inoxia e D. semi Ferox. 2. l'analisi diretta e in tempo reale dei parametri di fonte Ion Riscaldamento a gas Temperatura Impostare la temperatura del riscaldatore a gas della sorgente di ioni a 350 ° C. Modalità Ion Effettuare l'analisi in modalità ioni positivi con tensione di rete di 250 V. Elio Gas Portata Regolare la portata gas elio a 2,0 L / sec. 3. tempo di volo Mass Spectrometer Parameters Tensioni orifizio Impostare la tensione dell'orifizio 1 a 20 V e la tensione foro 2 a 5 V. Lens Ring e di picco di tensione Regolare la tensione della lente anello a 5V e cambiare la tensione picchi a 600 V. Messa spettrale Acquisizione Impostare la velocità di acquisizione spettrale di massa per 1 spettro al secondo su una gamma di massa di m / z 60-800. Mass Spectrometer potere risolvente Impostare il potere risolutivo dello spettrometro di massa a 6000 FWHM. 4. Analisi di materiali vegetali Analisi di Kratom foglia Premere il tasto "Start Esegui" nel software di controllo spettrometro di massa. Sospendere il chad di materiale vegetale tra la sorgente di ioni e l'ingresso spettrometro di massa (circa 2 cm dal ingresso) con le pinzette fino ad ottenere uno spettro. Ripetere 5 volte con chads separati di materiale vegetale. Calibrare lo spettro con polietilene glicole 600 (PEG). Immergere l'estremità chiusa del tubo capillare punto di fusione nello standard PEG. Sospendere il capillare rivestito between la sorgente di ioni e l'ingresso spettrometro di massa. Dopo aver analizzato lo standard PEG, selezionare il pulsante "Stop" per terminare la seduta analitica. Premere il tasto "Start Esegui" nel software di controllo spettrometro di massa. Sospendere una piccola quantità di materiale essiccato foglio tra la sorgente di ioni e l'ingresso spettrometro di massa con pinzetta fino ad ottenere uno spettro. Ripetere 5 volte, analizzando nuovo materiale vegetale di volta in volta. Calibrare lo spettro con PEG. Immergere l'estremità chiusa di una capillare nello standard PEG. Sospendere il capillare rivestita tra la sorgente di ioni e l'ingresso spettrometro di massa. Dopo aver analizzato lo standard PEG, selezionare il pulsante "Stop" per terminare la seduta analitica. Analisi di kratom in polvere Premere il tasto "Start Esegui" nel software di controllo spettrometro di massa. Immergere l'estremità chiusa di un punto di fusione capillare nella polvere kratom. suspend capillare steso fra la sorgente di ioni e l'ingresso spettrometro di massa fino a spettro viene ottenuta. Ripetere l'analisi 5 volte con un nuovo capillare ogni volta. Calibrare lo spettro con PEG. Immergere l'estremità chiusa di una capillare nello standard PEG. Sospendere il capillare rivestita tra la sorgente di ioni e l'ingresso spettrometro di massa. Dopo aver analizzato lo standard PEG, selezionare il pulsante "Stop" per terminare la seduta analitica. Analisi di kratom Estratto Immergere l'estremità chiusa del tubo capillare nel estratto. Sospendere il tubo capillare nel supporto 12-campione sulla guida lineare collegata allo spettrometro di massa. Ripetere 5 volte con un estratto di diverso ogni volta. Premere il tasto "Start Esegui" nel software di controllo spettrometro di massa. Utilizzando il pannello di controllo, selezionare il pulsante ">" per far avanzare la guida lineare attraverso il flusso di ioni al ritmo di 1 mm / sec araccogliere spettri. Calibrare lo spettro con PEG. Immergere l'estremità chiusa di una capillare nello standard PEG. Sospendere il capillare rivestita tra la sorgente di ioni e l'ingresso spettrometro di massa. Dopo aver analizzato lo standard PEG, selezionare il pulsante "Stop" per terminare la seduta analitica. L'analisi dei semi di Datura Premere il tasto "Start Esegui" nel software di controllo spettrometro di massa. Sospendere il seme a metà Datura tra la sorgente di ioni e l'ingresso spettrometro di massa con una pinzetta fino a quando viene raccolto uno spettro. Assicurarsi che la parte tagliata è orientato ad affrontare la sorgente di ioni. Ripetere 5 volte, l'analisi di un nuovo seme mezzo ogni volta. Calibrare lo spettro con PEG. Immergere l'estremità chiusa di una capillare nello standard PEG. Sospendere il capillare rivestita tra la sorgente di ioni e l'ingresso spettrometro di massa. Dopo aver analizzato lo standard PEG,selezionare il pulsante "Stop" per terminare la seduta analitica. Ripetere i passaggi 4.4.1-4.4.3 per ciascuna specie di Datura. 5. Data Processing File di dati Translating Nel software di elaborazione dei dati, selezionare File, "Traduci DART Files" con "calibrazione automatica" attivata, per creare i file di dati calibrati. A sinistra clic e trascinare una casella attorno al primo picco del cromatogramma e selezionare "Media" per creare uno spettro media. Fare clic destro e trascinare una casella intorno a una zona in cui è stato raccolto alcun campione e selezionare "intero dialogo Media come sfondo" per sottrarre sfondo dallo spettro media. Salvare lo spettro di massa come un file txt. Ripetere i punti 5.1.1-5.1.4 per ogni picco del cromatogramma per creare uno spettro in media per ogni replica nel file. Ripetere i passaggi 5.1.2-5.1.5 per ogni file raccolti. </ol> 6. Analisi statistica Analisi del componente principale Nella sezione Classifica del software di analisi spettrale (Vedere elenco dei materiali), sotto la scheda "Configurazione", creare classi per l'elaborazione dei dati selezionando "Aggiungi classe". Importare i file di testo di dati scegliendo "Add File (s)". Assegnare i file di dati nella classe appropriata di impianti selezionando i file di testo e "Set Class per i file selezionati". Selezionare la funzione masse di discriminazione da MS da Training Set e impostare Soglia% all'1%. Impostare una tolleranza di massa (MMU) a 10 e selezionare "Build vettori da file di dati". Nella sezione "Compute", eseguire l'analisi delle componenti principali, selezionando la casella per il 3D PCA Grafico e selezionare "Calcola". Eseguire leave-one-out convalida incrociata selezionando "Convalida (lento!)." <strong> Genera mappa di calore Nella scheda Frequenza Trama del software di analisi spettrale, generare una mappa di calore di dati scegliendo "mappa di calore." Selezionare "Soglia dati salvati" per impostare la soglia abbondanza al 1%. Esportare la mappa di calore di un foglio di calcolo selezionando "Salva Mappa di calore a Excel." Nel programma di foglio di calcolo, salvare la mappa di calore esportato come file di testo. Analisi clustering gerarchico Importare la mappa di calore come file .txt nel software Cluster 3.0. Nella scheda gerarchica dei Cluster 3.0, sotto Geni e array, caselle di controllo "Cluster" e "calcola pesi". Set di taglio a 0,1 e esponente a 1. Selezionare unico raggruppamento di linkage per eseguire l'analisi. Visualizza il file di dati .cdt generato in Java TreeView.

Representative Results

Rappresentante analisi diretta morbido ionizzazione modalità positiva ioni di litio in tempo reale, ad alta risoluzione dei dati di spettrometria di massa di kratom prodotti e semi Datura sono mostrati nelle figure 2 e 3. Vari composti precedentemente isolati da M. speciosa, compresi mitragynine (C 23 H 30 N 2 O 4 + H +, m / z 399,2284) e 7-hydroxymitragynine (C 23 H 30 N 2 O 5 + H +, m / z 415,2233), sono stati rilevati in tutti e quattro i campioni ed i corrispondenti dati di misura di massa sono presentati nella tabella 1. 4-8 dati rappresentante Datura sono mostrati in figura 3 e biomarcatori firmata e atropina (C 17 H 23 NO 3 + H +, m / z 290,1756) e scopolamina (C 17 H 21 NO 4 + H + </sup>, M / z 304.1549) sono stati rilevati nelle tre specie. Dati di misura di massa connessi con figura 3 sono riportate nella Tabella 2. 9-12 identità composti sono stati confermati attraverso la determinazione degli elementi di composizione, la corrispondenza degli isotopi, e il confronto di report in letteratura. 23-24 Mappa di calore rendering delle analisi diretta in tempo reale risoluzione spettrometria di massa spettri di tempo massimo di kratom e Datura sono illustrati nella Figura 4. I dati presentati sono stati utilizzati in analisi delle componenti principali (PCA) per distinguere tra le due classi di farmaci a base di piante di abusi (Figura 5). La trama PCA è stato costruito utilizzando dieci caratteristica masse (elencati nella tabella 3), con cerchi blu rappresentano i dati kratom e quadrati rossi rappresentano i dati Datura. La funzione masse selezionati corrispondevano a vari alcaloidi presenti inDatura o Mitragyna spp., Tra cui la composti psicoattivi atropina, scopolamina, mitragynine e 7-hydroxymitragynine. 23-24 Tre componenti principali hanno rappresentato il 75.26% della varianza e lasciare-one-out convalida incrociata (LOOCV) è stata del 100%. La trama PCA mostra chiaramente che i dati Kratom ei dati Datura sono ben risolti uno dall'altro. Analisi PCA ha anche rivelato che le singole varietà di kratom e le diverse specie di Datura potevano essere identificati e distinti l'uno dall'altro (Figura 6). LOOCV era 94.29%, con tre componenti principali che copre 75.26% della varianza. Le due varietà di kratom (Bali in cerchi blu e Rifat in quadrati rossi) grappolo insieme, indicando che essi appartengono alla specie M. speciosa, ma vengono risolti gli uni dagli altri, dimostrando che essi rappresentano diverse varietà. Inoltre, il gruppo di specie Datura insieme e separate dal M. spdati eciosa, ma ciascuna delle singole specie di Datura (D. inoxia in triangoli verdi, D. stramonium nelle piazze rosa e D. ferox nei circoli turchesi) sono chiaramente differenziati. Nonostante un punto dati per D. stramonio sembra essere un outlier, il seme è correttamente classificato come D. stramonium e non D. inoxia utilizzando PCA. La cosa più importante, la differenza di colore tra seme D. stramonium e D. inoxia conferma sono specie diverse e che il punto dati in questione non può essere D. inoxia. Clustering gerarchico (Figura 7) è stata eseguita senza la selezione a priori caratteristica masse. Al contrario, l'intero gruppo di insiemi di dati spettrali che coprono un range di massa di m / z 60-800 è stato importato in open source software di clustering genomico ed è stato prodotto un dendrogramma con questi dati. I risultati of HCA ha anche rivelato di classe, specie e varietà differenziazione basata esclusivamente su analisi diretta nei dati spettrometria di massa in tempo reale ad alta risoluzione derivati ​​e confermato quelli dell'analisi PCA. Le due classi di farmaci a base di piante di abuso, kratom e Datura, sono stati separati in singoli cladi del dendrogramma. Inoltre, le varietà Rifat e Bali di kratom sono stati isolati in ogni singolo sub-cladi all'interno della classe kratom. Analogamente, D. inoxia, D. ferox e D. stramonium sono state risolte nelle proprie cladi da specie all'interno della classe Datura. Figura 1. Le immagini di M. speciosa prodotti (kratom) e Datura spp semi di: Bali Kratom foglia secca; b:.. Bali kratom in polvere; c: Rifat kratom dal vivo impianto; <strong> D: D semi stramonium, e: D. semi inoxia; F: D. semi Ferox. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 2. Analisi diretta in tempo reale ad alta risoluzione spettrometria di massa di ioni positivi-spettri di M. speciosa (kratom) prodotti a: foglia fresca Rifat; b:. foglia Bali secca; c: polvere Bali; D: estratto di polvere di Bali. I dati di misura di massa associati a questi spettri sono riportati nella tabella 1. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 3. Analisi diretta in tempo reale risoluzione spettrometria di massa di ioni positivi-spettri tempo massimo di Datura spp. . semi di un: D. ferox; B: D. inoxia; c: D. stramonium. I dati di misura di massa connessi con questi spettri sono riportati nella tabella 2. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 4. mappa di calore rendering dell'analisi diretta in tempo reale ad alta risoluzione spettrometria di massa spettri dei materiali vegetali kratom e Datura. Ciaopicchi di intensità GH sono mostrati in picchi di intensità rosso ed inferiore scure sono indicate in tonalità più chiare. Fai clic qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 5. analisi delle componenti principali (PCA) trama di kratom e Datura prodotti costruiti utilizzando l'analisi diretta dei dati di spettrometria di derivazione massa ad alta risoluzione in tempo reale. Tre componenti principali (PC) rappresentano il 75,26% della variazione, e il congedo-one la validazione incrociata (LOOCV) è stata del 100%. La funzione masse utilizzate per la PCA sono riportati nella tabella 3. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page= "1"> Figura 6. analisi delle componenti principali (PCA) trama di kratom e Datura prodotti utilizzando l'analisi diretta dei dati in tempo reale ad alta risoluzione spettrometria di massa. Compiti in classe erano basate sulla varietà (kratom) o specie (Datura) dei materiali vegetali. Tre componenti principali (PC) rappresentano il 75,26% della variazione e il congedo-one-out convalida incrociata (LOOCV) è 94.29%. La funzione masse utilizzate per la PCA sono riportati nella tabella 3. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. Figura 7. Risultati clustering gerarchico ottenuti utilizzando l'analisi diretta in tempo reale time-alta risoluzione spettrometria di massa-derivati dati provenienti da analisi dei materiali vegetali kratom e Datura. Le due classi di piante sono nettamente separati in due rami distinti nel dendrogramma (indicato tra parentesi blu e rosso per il kratom e Datura, rispettivamente). Le specie di semi Datura sono anche risolti gli uni dagli altri (in verde, turchese e rosa infrante scatole per D. inoxia, D. ferox, e D. stramonium, rispettivamente). I materiali vegetali kratom sono separati da varietà (mostrati in caselle rosse e blu tratteggiata per Rifat e Bali, rispettivamente). Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura. Tabella 1. i dati di misura di massa connessi con gli spettri di ionizzazione morbida di kratom produCTS presentati nella figura 2. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa tabella. Tabella 2. dati di misura di massa connessi con gli spettri di ionizzazione morbida di semi Datura presentati nella figura 3. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa tabella. Tabella 3. masse Feature utilizzati per la principale trama analisi delle componenti di kratom e Datura prodotti illustrati nelle figure 5 e 6.

Discussion

La capacità di identificare i farmaci a base vegetale di abuso è di aumentare la necessità a causa del drammatico aumento nella commercializzazione, vendita e consumo di sostanze psicoattive non programmate. ² I metodi tradizionali per l'identificazione del materiale botanico di solito comportano la caratterizzazione di caratteristiche fisiche accoppiato con l'analisi del componenti chimici con metodi di spettrometria di massa cromatografici-trattino. Tuttavia, entrambi questi approcci sfide presenti per l'analisi semplificata. Caratteristiche fisiche delle piante sono spesso distrutte quando le piante vengono essiccati, polverizzata o estratti durante il processo di fabbricazione e, come tale, è spesso difficile distinguere un tipo di prodotto psicotropi vegetale da un altro basato sulle sole caratteristiche fisiche. ²³ Analisi per metodi di spettrometria di massa cromatografici-possono consentire l'identificazione dei composti psicoattivi in ​​matrici vegetali, ma la preparazione del campione e lo sviluppo del metodo è il tempo di unND molte risorse, e la creazione di nuovi protocolli per ogni classe o specie di farmaci a base di piante di abuso non è praticabile in molti laboratori di chimica forense.

Analisi diretta nel settore della spettrometria di massa risoluzione tempo-alta aggira alcune di queste sfide, come matrici complesse come foglie, polveri, estratti e semi possono essere analizzati con poca preparazione del campione. Nonostante le complesse matrici dei materiali campionati qui, i costituenti psicoattivi erano facilmente identificabili, anche a concentrazioni nanogrammi, ²¹ a causa della elevata sensibilità dello spettrometro di massa. Semi, foglie e polveri sono state dimostrate per essere facilmente analizzati mediante analisi diretta in real spettrometria di massa risoluzione tempo-alto, e una varietà di altri tipi di materiali possono anche essere campionati nello stesso modo, compresi TLC lastre, valuta, compresse, fiori, fase solida microestrazione (SPME) fibre e involucri puparial persino insetti. ^21-22 Attraverso massa accurata analisi, elementale determinazione composizione e isotopica corrispondenza, biomarker e composti di interesse possono essere identificati, indipendentemente dal fatto che i composti sono contenute in un foglio, macchiato su una piastra TLC o spalmati su un tubo capillare.

Analisi diretta in tempo reale metodologia spettrometria di massa risoluzione tempo-alta può essere utilizzato per l'analisi semplificata in quanto vi sono pochi parametri che devono essere modificati da esperimento a esperimento. L'analisi può essere eseguita in modalità negativa ioni positivi-ionico o, e molecole di fino a 3.000 amu può essere rilevato in entrambi i casi. Ionizzazione in modalità positiva ioni avviene per trasferimento di protoni da cluster acqua attivati, ²¹ e qualsiasi composto con un'affinità protonica superiore a quella dell'acqua sarà ionizzato. Qui, modalità positiva ioni è stato utilizzato a causa della elevata affinità protonica di alcaloidi, che fa sì che vengano facilmente ionizzati dalla protonazione. Analisi in modalità di ioni negativi può essere utilizzato per l'individuazione di hydrocarbons (come O ₂ addotti) ^21, materiali esplosivi ²⁷ e acidi organici come artesunato nei farmaci malariche. ²⁸ a causa del metodo di ionizzazione del protone-trasferimento e l'incapacità di produrre ioni a carica multipla, l'analisi diretta della massa in tempo reale ad alta risoluzione spettrometria è limitata principalmente all'analisi di piccole molecole fino a 3.000 amu.

Oltre modalità di ionizzazione, la temperatura della sorgente di ioni è un parametro importante e la temperatura dipende in larga misura campione analizzato. Ad esempio, è importante usare temperature più basse (~ 250 ° C) per l'analisi della fibra SPME per prevenire la distruzione del materiale di rivestimento sulla fibra, mentre le temperature più elevate (~ 500 ° C) devono essere utilizzati per l'analisi degli aminoacidi per desorbimento e successiva ionizzazione. Qui, vegetali analisi materiale sono state condotte a 350 ° C, in quanto permette di ionizzazione alcaloidi e altri composti di interesse consenza causare pirolisi di composti nella matrice vegetale.

Analisi diretta a risoluzione reale analisi di spettrometria di massa di tempo elevato non permette solo l'identificazione dei costituenti psicoattivi del materiale vegetale a base di masse accurate, determinazione composizione elementare e corrispondenza isotopo, ma produce anche le impronte digitali chimiche uniche che possono essere sfruttate per l'identificazione delle specie utilizzando analisi statistica multivariata con risultati altamente riproducibili, anche con set di dati più piccoli. l'analisi statistica multivariata è stata applicata a una vasta gamma di analisi diretta nei dati di spettrometria di massa in tempo reale ad alta risoluzione, compreso quello derivato dal legno, involucri puparial, semi, materiale fogliare, e fuelstocks biodiesel, in mostra la versatilità e la riproducibilità del metodo. ^22-26 le funzionalità high-throughput di analisi diretta nel settore della spettrometria di massa risoluzione temporale di alto consentono l'acquisizione di grandi quantità di Spectr di massadati Al in un breve periodo di tempo, e il gran numero di repliche necessarie per l'analisi statistica sono facilmente acquisite utilizzando questo metodo. L'analisi diretta nel settore della spettrometria di massa risoluzione tempo-alta set di dati di massa spettrale di Datura e kratom era composto da oltre 100 spettri individuali che sono stati raccolti con meno di un'ora di investimento totale di tempo. Per ottenere lo stesso numero di spettri mediante GC-MS con un programma di temperatura del forno di 30 minuti richiederebbe circa 50 ore, senza considerare il tempo aggiunto per procedura di preparazione del campione, come l'estrazione o derivatizzazione.

Analisi delle componenti principali può essere utilizzato per evidenziare variazioni tra gruppi di sostanze vegetali in base alla presenza e l'intensità delle masse funzione selezionata. L'elaborazione di analisi statistica fornisce l'identificazione delle specie, così come le informazioni varietale. Altri metodi di analisi statistica, come l'analisi di clustering gerarchico (HCA), può anche essereapplicate senza la selezione a priori caratteristica masse. I risultati di HCA delle impronte digitali chimiche complete dimostrano che l'analisi statistica senza supervisione può essere applicato con successo per l'identificazione delle specie di farmaci a base di piante di abuso. ²⁵

La discriminazione specie di materiale botanico forense mediante analisi diretta in real spettrometria di massa risoluzione tempo-alta è stata dimostrata usando l'identificazione di composti psicotropi e altri biomarker nella spettri di massa morbida ionizzazione, e l'applicazione di analisi statistica multivariata. L'applicazione dei due tipi di analisi statistiche rivelato non solo che la classe di un farmaco vegetale di abuso può essere identificato, ma anche che la varietà e specie di detto farmaco può essere determinata sulla base delle impronte chimiche uniche osservati mediante analisi diretta tempo-reale ad alta risoluzione spettrometria di massa. Il metodo presentato qui permette la rapida identificazione high-throughput di misostanze nd alterano in modo da eludere sfide incontrate in metodi analitici convenzionali, e fornisce laboratori forensi con un mezzo per caratterizzare e identificare materiale vegetale psicoattiva senza tempo e risorse di sviluppo metodo intensivo. Questo protocollo può essere esteso alla differenziazione delle specie di una varietà di altri materiali di origine vegetale. ^22-26

Materials

AccuTOF Mass Spectrometer	JEOL USA, Inc.
DART-SVP Ion Source	IonSense, Inc.	DART-SVP
Linear Rail System	IonSense, Inc.	HW-10029
Hole puncher (6 mm)	Swingline	A7074005
One-Pint Compact Ultrasonic Cleaner	Cole-Palmer	EQ-08849-00
1.5 mL Eppendorf Microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	02-682-550
AccuSpin Micro 17R Centrifuge	Fisher Scientific	13-100676
#9 Stainless Steel Razor blade	Stanley	11-515
Dip-it Tip Holder	IonSense, Inc.	SCT-70003
Dip-it Tips	IonSense, Inc.	DPT-110
Melting Point Capillary	Krackeler Scientific	1-9530-3
Polyethylene glycol (600)	Sigma Aldrich	81180
Rifat Kratom Live Plant	World Seed Supply Kratom Collection	LIVEKRATOMPLANT
Bali Kratom Dried Leaf	The Kratom King	OZKRAPCOM
Bali Kratom Powder	The Kratom King	OZKRAPCOMPOW
Datura stramonium seeds	Horizon Herbs LLC	PDATUJ
Datura inoxia seeds	Horizon Herbs LLC	PDATUM
Datura ferox seeds	Georgia Vines	255/737
Ethanol, anhydrous	Krackeler Scientific	1328-E402-4L
Mass Mountaineer Spectral Analysis Software	mass-spec-software.com	MM-20030-PCA-DVD
TSSPro3 Data Processing/Data Reduction Software	Shrader Labs
Cluster 3.0	http://bonsai.hgc.jp/~mdehoon/software/cluster/software.htm		Open Source Software
Java Treeview	http://jtreeview.sourceforge.net/		Open Source Software