Rilevamento di RNA-binding proteins by<em> In Vitro</em> RNA a tendina nella cultura degli adipociti
Summary
Un protocollo di pull-down RNA è ottimizzato qui per il rilevamento delle interazioni tra RNA-binding proteins (RBPs) e non codificante e RNA codificanti. Un frammento di RNA da recettore degli androgeni (AR) è stato usato come esempio per dimostrare come recuperare la sua RBP da lystate degli adipociti bruni primarie.
Abstract
RNA-binding proteins (RBPs) stanno emergendo come uno strato di regolamentazione per lo sviluppo e la funzione del tessuto adiposo. RBPs svolgono un ruolo chiave nella regolazione dell'espressione genica a livello post-trascrizionale che interessano l'efficienza stabilità e traslazionale di mRNA bersaglio. RNA tecnica di pull-down è stato ampiamente utilizzato per studiare l'interazione RNA-proteina, che è necessario per chiarire il meccanismo sottostante funzione di RBPs 'così come lungo RNA non codificanti' (lncRNAs). Tuttavia, la grande abbondanza di lipidi negli adipociti rappresenta una sfida tecnica nella conduzione di questo esperimento. Ecco una dettagliata protocollo di pull-down RNA è ottimizzato per la cultura adipociti primaria. Un frammento di RNA da (AR) 3 'regione non tradotta del recettore degli androgeni (3'UTR) contenente un elementwas ricco adenilato-uridylate-usato come esempio per dimostrare come recuperare il suo partner RBP, proteine HuR, da adipociti lystate. Il metodo qui descritto può essere applicato per rilevare le interazioni traRBPs e RNA non codificanti, così come tra i RBPs e RNA codificanti.
Introduction
RBPs sono proteine che si legano all'RNA doppia o singola bloccati in cellule e partecipano a formare complessi RNA-proteina. RBPs possono vincolare una varietà di specie di RNA, inclusi mRNA e RNA non codificanti lunghi (lncRNAs), e di esercitare la loro influenza a livello post-trascrizionale. Entrambi RBPs e lncRNAs stanno emergendo come nuovi regolatori nello sviluppo adiposo e funzionano 1,2,3. Per comprendere il meccanismo di RBP- e regolazione lncRNA-mediata vie cellulari, è spesso necessario rilevare l'interazione tra una molecola di RNA specifico e uno o più RBPs, e, a volte, per identificare l'intero spettro di partner proteici di un RNA trascrizione. Tuttavia, l'esperimento può essere difficile a causa dell'elevato contenuto di lipidi in adipociti. L'RNA protocollo tendina qui descritto può essere impiegato per recuperare i partner proteici di un RNA specifico dai lisati adipociti di colture primarie di 4,5.
Motivazioni per questo protoCol è riassunta come segue. Un esca RNA è trascritto in vitro da un modello di DNA, biotina-etichettati e coniugato con biglie magnetiche rivestite di streptavidina 4. L'esca RNA viene incubato con lisati cellulari per permettere la formazione di complessi RNA-proteina, che vengono successivamente abbassate su un supporto magnetico. Più specificamente, il protocollo di pull-down RNA descritto di seguito utilizzare un frammento di RNA da AR 3'UTR come esca per recuperare HuR proteina, un RBP universalmente espressa vincolato al 3'UTR del mRNA 6,7, da theadipocytelysate di coltura primaria. Per testare la specificità di legame di questo saggio, un RNAas non rilevanti e perline streptavidina vuote è incluso come controllo. Questo protocollo è compatibile con western blotting o spettrometria di massa (MS) per confermare la cattura di un RBP specifica o per identificare la piena repertorio di RBPs catturati, rispettivamente 8.
Diverse tecniche sono a disposizione per studiare l'interazione RNA-proteinaS. Per rivelare RNA legati da un dato RBP, RIP (RNA immunoprecipitazione) e CLIP (reticolazione UV e immunoprecipitazione) può essere applicata. Al contrario, per identificare i partner proteici di un dato RNA, RNA pull-down, Chirp (isolamento cromatina da purificazione RNA), CHART (cattura analisi ibridazione degli obiettivi di RNA) e RAP (purificazione RNA antisenso) può essere applicata. In confronto con quelle successive, RNA tecnica discesa richiede meno sforzo di creare. Può essere impiegato per catturare proteine in vitro e in vivo. L'approccio in vivo di RNA pull-down, che è tecnicamente più impegnativo rispetto al suo omologo in vitro, conserva le interazioni RNA-proteina da reticolazione nelle cellule, cattura RNA aptamer-tag di interesse da cellule, e rileva in seguito RBPs rilegati. RNA pull-down può essere utilizzato per arricchire bassi RBPs abbondanti, e per isolare e identificare i complessi RNA-proteina che hanno diversi ruoli funzionali nel controllo della regolazione cellulare 9,10 </sup>.
Protocol
Representative Results
Discussion
lncRNAs e RBPs hanno un ruolo vitale nella salute e la malattia, tuttavia i meccanismi molecolari di queste molecole sono poco conosciuti. Identificazione di proteine che interagiscono con le molecole lncRNA è un passo fondamentale verso la comprensione dei meccanismi di regolazione. Arricchimento del RBPs da parte del sistema di analisi a tendina RNA si basa sulla cattura in-soluzione di interagire complesso in modo che le proteine da un lisato cellulare possono essere selettivamente estratti utilizzando e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato finanziato dalla Singapore NRF borsa di studio (NRF-2011NRF-NRFF001-025), così come CBRG (NMRC / CBRG / 0070/2014).
Materials
| Major materials used in this study. | |||
| MEGAscript kit | Ambion | ||
| Biotin-14-CTP | Invitrogen | ||
| NucAway spin columns | Ambion | ||
| Dynabeads M-280 Streptavidin | Invitrogen | ||
| HuR (3A2) mouse monoclonal antibody (sc-5261) | Santa Cruz Biotechnology | ||
| Goat anti-mouse IgG-HRP(sc-2005) | Santa Cruz Biotechnology | ||
| Hypure Molecular Biology Grade Water (nuclease-free) | HyClone | ||
| Phosphate Buffer Saline (1×PBS) | HyClone | ||
| RNase inhibitor | Bioline | ||
| Protease inhibitor | Sigma | ||
| Pfu Turbo DNA polymerase | Agilent Technologies | ||
| TRIsure | Bioline | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Major equipment used in this study. | |||
| Sorvall Legend Micro 21R centrifuge | Thermo Scientific | ||
| Sorvall Legend X1R centrifuge | Thermo Scientific | ||
| Bio-Rad T100 thermal cycler | Bio-Rad | ||
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | ||
| BOECO rotator Multi Bio RS-24 | BOECO,Germany | ||
| Protein gel electrophoresis and blotting apparatus | Bio-Rad | ||
| DynaMag-2 magnet | Life Technologies |
References
- Huot, M. &. #. 2. 0. 1. ;., et al. The Sam68 STAR RNA-binding protein regulates mTOR alternative splicing during adipogenesis. Mol Cell. 46 (2), 187-199 (2012).
- Sun, L., et al. Long noncoding RNAs regulate adipogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (9), 3387-3392 (2013).
- Engreitz, J. M., et al. The Xist lncRNA exploits three-dimensional genome architecture to spread across the X-chromosome. Science. 341 (6147), 1237973 (2013).
- Zhao, X. Y., Li, S., Wang, G. X., Yu, Q., Lin, J. D. A long noncoding RNA transcriptional regulatory circuit drives thermogenic adipocyte differentiation. Mol Cell. 55, 372-382 (2014).
- Alvarez-Dominguez, J. R., et al. De novo reconstruction of adipose tissue transcriptomes reveals long non-coding RNA regulators of brown adipocyte development. Cell Metab. 21, 764-776 (2015).
- Adams, D. J., Beveridge, D. J., van der Weyden, L., Mangs, H., Leedman, P. J., Morris, B. J. HADHB, HuR, and CP1 bind to the distal 3-untranslated region of human renin mRNA and differentially modulate renin expression. J Biol Chem. 278 (45), 44894-44903 (2003).
- Yeap, B. B., et al. Novel binding of HuR and poly(C)-binding protein to a conserved UC-rich motif within the 3´ untranslated region of the androgen receptor messenger RNA. J Biol Chem. 277, 27183-27192 (2002).
- König, J., Zarnack, K., Luscombe, N. M., Ule, J. Protein-RNA interactions: new genomic technologies and perspectives. Nat Rev Genet. 13, 77-83 (2012).
- Ferrè, F., Colantoni, A., Helmer-Citterich, M. Revealing protein-lncRNA interaction. Briefings in Bioinformatics. , 1-11 (2015).
- McHugh, C. A., Russell, P., Guttman, M. Methods for comprehensive experimental identification of RNA-protein interactions. Genome Biol. 15 (1), 203 (2014).
- Lee, Y. S., et al. AU-rich element-binding protein negatively regulates CCAAT enhancer binding protein mRNA stability during long term synaptic plasticity in Aplysia. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (38), 15520-15525 (2012).
- Hermann, M., Cermak, T., Voytas, D. F., Pelczar, P. Mouse genome engineering using designer nucleases. J Vis Exp. (86), (2014).
- Tsai, M. C., et al. Long Noncoding RNA as Modular Scaffold of Histone Modification Complexes. Science. 329 (5992), 689-693 (2010).
- Wan, Y., et al. Landscape and variation of RNA secondary structure across the human transcriptome. Nature. 505, 706-709 (2014).
- Li, H., et al. Identification of mRNA binding proteins that regulate the stability of LDL receptor mRNA through AU rich elements. J Lipid Res. 50 (5), 820-831 (2009).
- McHugh, C. A., et al. The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3. Nature. 521 (7551), 232-236 (2015).
- Chu, C., et al. Systematic Discovery of Xist RNA Binding Proteins. Cell. 161 (2), 404-416 (2015).
- Chu, C., Spitale, R. C., Chang, H. Y. Technologies to probe functions and mechanisms of long noncoding RNAs. Nat Struct Mol Biol. 22 (1), 29-35 (2015).
- Zhao, J., et al. Genome-wide identification of Polycomb-associated RNAs by RIP-seq. Mol Cell. 40 (6), 939-953 (2010).
