Canlı Zebra balığı Embriyo Mitotik Bölümü ve Dinamikleri gözlemleme
Summary
Mitosis is critical to every living organism and defects often lead to cancer and developmental disorders. Using this imaging protocol and zebrafish as a model system, researchers can visualize mitosis in a live vertebrate organism and the multitude of defects that arise when mitotic processes are defective.
Abstract
Mitoz organizma büyümesi ve farklılaşması için çok önemlidir. süreç son derece dinamik ve küçük bir zaman dilimi içinde uygun kromatin yoğunlaşması, mikrotübül kinetochore eki, kromozom ayrımı ve sitokinezi gerçekleştirmek için olayları sipariş gerektirir. hassas bir süreç hatalar doğum kusurları ve kanser de dahil olmak üzere, insan hastalığı ile sonuçlanabilir. İnsan mitotik hastalık durumları araştıran geleneksel yaklaşımlar genellikle insan hastalığı okuyan zaman doğal fizyolojisini ve avantajlı gelişimsel / doku-spesifik bağlamı eksikliği hücre kültür sistemleri, güveniyor. Bu protokol, yüksek çözünürlüklü, bir omurgalı sisteminde kromozom dinamikleri, Zebra ile görselleştirmek için bir yol sunarak birçok engellerin üstesinden. Bu protokol detay içeren bölünen hücrelerin, dinamik görüntüler elde etmek için kullanılabilecek bir yaklaşım olacaktır: In vitro transkripsiyon, Zebra balığı yetiştiriciliği / toplama, embriyo gömme ve zaman atlamalı görüntüleme. Optimizasyon ve modifBu protokolün ications de incelenmiştir. H2A.F / Z-EGFP kullanılması ve mCherry CAAX (etiketler hücre zarı) mRNA enjekte edilmiş embriyolar, AB vahşi tip, auroraB hi1045 ve mutant zebra balığı görüntülenmiştir esco2 hi2865 mitoz (kromatin etiketler). Zebra balığı yüksek çözünürlüklü canlı görüntüleme bir istatistiksel mitotik kusurları ve mitotik ilerlemesi zamanlamasını ölçmek için birden fazla mitoz gözlemlemek sağlar. Buna ek olarak, yanlış (yani, congression kusurları, kromozomların missegregation, vs.) mitotik süreçleri ve yanlış kromozom sonuçları (yani, anöploidi, poliploidi, mikronuklei, vs.) tanımlayan niteliksel yönlerini gözlem görülmektedir. Bu deney, doku farklılaşması / gelişme gözlem uygulanan ve mutant zebrabalıkları ve farmakolojik maddelerin kullanımı için uygun olan edilebilir. mitoz kusurları, kanser ve gelişimsel bozukluklara olacak büyük ölçüde yol nasıl görselleştirmehastalığın patogenezinde anlayışı geliştirmek.
Introduction
Mitoz canlı bir organizmada büyümesi, farklılaşması ve rejenerasyonu için kritik bir hücresel prosesin gereklidir. Doğru hazırlanması ve interfaz DNA replikasyonu üzerine, hücre bölünmesi astarlanmalıdır. mitoz, ilk safhada, birinci faz, siklin B / CDK1 aktivasyonu ile başlatılır. Profaz kromozomlarına kromatin malzemesinin yoğunlaşma ile karakterize edilir. Nükleer zarf arıza profaz ve prometafaz arasındaki geçiş gerçekleşir. prometafaz olarak, sentrozomlar, iğ oluşumu için çekirdeklenme merkezi, kinetochore eki arama Mikrotübülleri uzatırken zıt kutuplarda göç etmeye başlar. Eki üzerine, dönüşümler mikrotübül eki-end ve gerilim kuvvetleri metafaz plakası 1 oluşturan kromozom yönlendirmek. Tüm kromozomlar doğru bağlıysa, iğ montaj kapısı, memnun olduğunu birlikte kardeş kromatidler tutan kohezinin halkaları ayrılmaktadır ve mikrotübül kardeşi çekmek için kısaltmakanafaz 2,3 sırasında zıt kutuplara kromatidler. Son aşama, telofaz, iki yeni çekirdeklerin etrafında nükleer zarfın hücre ve reform uzamasını içerir. Sitokinez iki yeni yavru hücrelere 4-6 sitoplazma ayırarak bölme işlemini tamamlar. Anahtar mitotik yollar (yani iğ montaj kontrol noktasında, sentrozom kopyalanması, kardeş kromatid uyum, vb.) Değiştirilmesi metafaz tutuklama, kromozomların missegregation ve genomik instabilite 7-10 neden olabilir. Sonuçta, yollar kontrol mitoz kusurları gelişimsel bozuklukları ve kanser, mitoz gerektiren görselleştirme ve canlı, omurgalı, çok hücreli organizma 10-16 yılında kusurlarına sebep olabilir.
Zebra balığı embriyolar nedeniyle şeffaf dokusu, mikroenjeksiyon kolaylığı ve hızlı bir gelişme canlı görüntüleme için büyük bir model organizma olarak hizmet vermektedir. zebrafish kullanarak, bu yazının genel amacı olancanlı 5D mitoz 17 (Şekil 1C) (X, Y, Z, saat ve dalga boyu) görüntüleme için bir yöntem tarif eder. Farklı mitotik yollardaki kusurlu mutant zebrafish kullanılması bu tür arızalardan sonucu göstermektedir. Bu protokol için, Aurora B ve Esco2 mutantlar bu hataları göstermek için seçildi. Aurora B mili oluşumu ve mikrotübül bağlanma yer kromozom yolcu kompleksi (TBM) bir parçası olan bir kinazdır. Ayrıca, sitokinez 18,19 bölünme karık oluşumu için gereklidir. Zebra balığı, Aurora B eksikliği karık indüksiyon, sitokinez, ve kromozom ayrımı 20 hatalarına yol açar. Esco2, diğer taraftan, kardeş kromatid uyum 21,22 için gerekli olan bir asetiltransferaz olduğu. Böylece, metafaz-anafaz geçiş 23 de uygun kromozom ayrımı sağlamak için cohesin stabilize halkanın SMC3 kısmında cohesin acetylates. zebrabalıkları Esco2 kaybı ch yol açarromosome missegregation, erken kardeş kromatid ayrılması, genomik istikrarsızlık ve p53-bağımlı ve bağımsız apoptoz 24,25. Nedeniyle durumunu, auroraB hi1045 ve esco2 hi2865 mutant zebra balığı bu tekniği 25-27 göstermek için kullanılacaktır (bundan sonra aurB a / a ve esco2 a / a, sırasıyla şu şekilde adlandırılır).
Floresan etiketli hücre makine ile Kaplin konfokal mikroskopi mitoz 25,28,29 sırasında kromatin ve hücre zarı dinamiklerini görselleştirmek için araştırmacıların sağladı. Floresan etiketli histon tarihsel kromatin görselleştirmek için kullanılmıştır. Histonlar kromozom 30 oluşturan nükleozom yapısının sorumlu olan dört farklı çiftlerin (H2A, H2B, H3 ve H4) oluşan çekirdek proteinleridir. H2B tartışmasız floresan proteinleri en çok kullanılan histon ikenFare ve hücre kültürü, Histon 2A kullanımı Aile Z'nin (H2A.F / Z) zebrabalıkları 31,32 kullanılmak için de kanıtlamıştır. Konkanavalin A ve kasein kinaz 1-y, örneğin, hücre zarı lokalize ve daha önce deniz kestanesi ve Drosophila 33,34 hücre zarı görselleştirme etkili gösterilmiştir. Diğer çalışmalar CAAX floresan etiketli protein, hücre zarı etiketler göstermiştir ve Zebra balığı 31 başarılı oldu var. CAAX gibi farnesyltransferases ve Geranilgeraniltransferazlar gibi post-translasyonel modifiye enzimler tarafından tanınan bir motiftir. Bu enzimler tarafından değişiklikler proteinleri, hücre zarı 35 etiketleme, zara bağlı hale neden olur.
Nedeniyle zebrabalıkları önceki kullanım, bu protokol kromatin ve hücre zarı etiketlemek için H2A.F / Z ve CAAX kullanmayı seçti. Bu yöntemin uygulanması bireysel kromozom gözlemlemek için araştırmacı bireysel hücre düzeyinde mitoz izlemesini sağlayacakdinamikler, hem de aynı anda doku farklılaşması ve geliştirme etkileyebilecek birden fazla hücre bölünmeleri izlemek. Bu makale, bireysel hücre seviyesinde mitoz sırasında kromozom ayrımı dinamiklerini görüntüleme üzerinde durulacak. Bu yazının içinde, çeşitli mitoz bölünmeler gözlemlemek bölünme zamanı hesaplamak ve mitotik fenotipleri deşifre yeteneği resimli ve tartışılacaktır. Bu parametreler kullanılarak, fizyolojik ilgili veriler toplanabilir ve mitoz arızalardan etkilenen birçok hastalık durumlarıyla başvurdu.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu yöntemin kullanılması bir in vivo ve zamana bağlı bir şekilde iki yeni hücre oluşturmak için nükleer zarf arıza, mikrotübül kinetochore ekleri ile metafaz plaka oluşumunu ve kardeş kromozomlardalerde ayrımını anlaması için izin verir. Hücreler doğal fizyolojisi görüntülü çünkü zebrafish mitoz gözlemlemek yeteneği, doku floresan proteinleri kullanılabilmesi için, onlar nispeten hızlı geliştirmek ve zaman atlamalı görüntüleme sağlayan şeffaf sabit örnekleri ve hücre …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Kristen Kwan for the pCS2-H2A.F/Z-EGFP and pCS2-mCherry-CAAX vectors. We thank Chris Rodesch for tutoring us in live imaging in zebrafish. We thank Shawn Williams, Erik Malarkey and Brad Yoder for assistance in confocal imaging at UAB and the High Resolution Imaging Facility at UAB. The High Resolution Imaging Facility is supported by the UAB Comprehensive Cancer Center Support Grant (P30CA013148) and the Rheumatic Disease Core Center (P30 AR048311). J.M.P. is supported by the National Institute of Neurological Disease and Stroke (NIH R21 NS092105), and pilot grants from American Cancer Society (ACS IRG-60-001-53-IRG) and the UAB Comprehensive Cancer Center (P30CA013148). S.M.P. is supported by the Cell and Molecular Biology T32 Training Grant (5T32GM008111-28).
Materials
| pCS2 vectors | Gift from K. Kwan | For plasmid of interest | |
| NotI-HF restriction enzyme | New England BioLabs | R3189S | For restriction digest of plasmid |
| mMessage SP6 kit | Life Technologies | AM1340 | For in vitro transcription |
| RNeasy Mini kit | Qiagen | 74104 | For purifying mRNA |
| 100 x 15 mm petri dishes | Fisher Scientific | FB0875712 | For housing embryos |
| microinjection mold | homemade | For holding embryos during microinjection | |
| Agarose II | Amresco | 0815-25G | For embedding embryos |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521-10G | For anesthetizing embryos |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| Calcium Chloride Dihydrate | Sigma-Aldrich | C8106 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| Magnesium Sulfate | Fisher Scientific | M7506 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| Methylene Blue Hydrate | Sigma-Aldrich | MB1 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| 100 mm culture tube | Fisher Scientific | 50-819-812 | For melted agar |
| 35 mm glass coverslip bottom culture dish | MatTek Corp | P35G-0-20-C | No. 0, 20 mm glass, For embedding embryos |
| #5 tweezers | Dumont | 72701-D | For dechorionating embryos |
| 21G 1 1/2 gauge needle | Becton Dickinson | 305167 | For positioning embryos in agar |
| Dissecting microscope | Nikon AZ100 | For screening and embedding embryos, any dissecting scope will do | |
| Confocal microscope | Nikon A1+ | For time-lapse imaging | |
| Confocal software | NIS Elements AR 4.13.00 | For image acquisition and processing |
References
- Musacchio, A., Hardwick, K. G. The spindle checkpoint: structural insights into dynamic signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (10), 731-741 (2002).
- Li, X., Nicklas, R. B. Mitotic forces control a cell-cycle checkpoint. Nature. 373 (6515), 630-632 (1995).
- Rieder, C. L., Cole, R. W., Khodjakov, A., Sluder, G. The checkpoint delaying anaphase in response to chromosome monoorientation is mediated by an inhibitory signal produced by unattached kinetochores. J Cell Biol. 130 (4), 941-948 (1995).
- Hayles, J., Nurse, P. A review of mitosis in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Exp Cell Res. 184 (2), 273-286 (1989).
- Pederson, T. Historical review: an energy reservoir for mitosis, and its productive wake. Trends Biochem Sci. 28 (3), 125-129 (2003).
- Sobel, S. G. Mini review: mitosis and the spindle pole body in Saccharomyces cerevisiae. J Exp Zool. 277 (2), 120-138 (1997).
- Thompson, S. L., Compton, D. A. Chromosome missegregation in human cells arises through specific types of kinetochore-microtubule attachment errors. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (44), 17974-17978 (2011).
- Duijf, P. H., Benezra, R. The cancer biology of whole-chromosome instability. Oncogene. 32 (40), 4727-4736 (2013).
- Lara-Gonzalez, P., Taylor, S. S. Cohesion fatigue explains why pharmacological inhibition of the APC/C induces a spindle checkpoint-dependent mitotic arrest. PLoS One. 7 (11), 49041 (2012).
- Araujo, A., Baum, B., Bentley, P. The role of chromosome missegregation in cancer development: a theoretical approach using agent-based modelling. PLoS One. 8 (8), 72206 (2013).
- Deardorff, M. A., et al. HDAC8 mutations in Cornelia de Lange syndrome affect the cohesin acetylation cycle. Nature. 489 (7415), 313-317 (2012).
- Chetaille, P., et al. Mutations in SGOL1 cause a novel cohesinopathy affecting heart and gut rhythm. Nat Genet. 46 (11), 1245-1249 (2014).
- Kaiser, F. J., et al. Loss-of-function HDAC8 mutations cause a phenotypic spectrum of Cornelia de Lange syndrome-like features, ocular hypertelorism, large fontanelle and X-linked inheritance. Hum Mol Genet. 23 (11), 2888-2900 (2014).
- Snape, K., et al. Mutations in CEP57 cause mosaic variegated aneuploidy syndrome. Nat Genet. 43 (6), 527-529 (2011).
- Suijkerbuijk, S. J., et al. Molecular causes for BUBR1 dysfunction in the human cancer predisposition syndrome mosaic variegated aneuploidy. Cancer Res. 70 (12), 4891-4900 (2010).
- Vega, H., et al. Roberts syndrome is caused by mutations in ESCO2, a human homolog of yeast ECO1 that is essential for the establishment of sister chromatid cohesion. Nat Genet. 37 (5), 468-470 (2005).
- Andrews, P. D., Harper, I. S., Swedlow, J. R. To 5D and beyond: quantitative fluorescence microscopy in the postgenomic era. Traffic. 3 (1), 29-36 (2002).
- Nigg, E. A. Mitotic kinases as regulators of cell division and its checkpoints. Nat Rev Mol Cell Biol. 2 (1), 21-32 (2001).
- Carlton, J. G., Caballe, A., Agromayor, M., Kloc, M., Martin-Serrano, J. ESCRT-III governs the Aurora B-mediated abscission checkpoint through CHMP4C. Science. 336 (6078), 220-225 (2012).
- Yabe, T., et al. The maternal-effect gene cellular island encodes aurora B kinase and is essential for furrow formation in the early zebrafish embryo. PLoS Genet. 5 (6), 1000518 (2009).
- Hou, F., Zou, H. Two human orthologues of Eco1/Ctf7 acetyltransferases are both required for proper sister-chromatid cohesion. Mol Biol Cell. 16 (8), 3908-3918 (2005).
- Ivanov, D., et al. Eco1 is a novel acetyltransferase that can acetylate proteins involved in cohesion. Curr Biol. 12 (4), 323-328 (2002).
- Beckouet, F., et al. An Smc3 acetylation cycle is essential for establishment of sister chromatid cohesion. Mol Cell. 39 (5), 689-699 (2010).
- Monnich, M., Kuriger, Z., Print, C. G., Horsfield, J. A. A zebrafish model of Roberts syndrome reveals that Esco2 depletion interferes with development by disrupting the cell cycle. PLoS One. 6 (5), 20051 (2011).
- Percival, S. M., et al. Variations in dysfunction of sister chromatid cohesion in esco2 mutant zebrafish reflect the phenotypic diversity of Roberts syndrome. Dis Model Mech. 8 (8), 941-955 (2015).
- Amsterdam, A., Hopkins, N. Retroviral-mediated insertional mutagenesis in zebrafish. Methods Cell Biol. 77, 3-20 (2004).
- Amsterdam, A., et al. Identification of 315 genes essential for early zebrafish development. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (35), 12792-12797 (2004).
- Jeon, H. Y., Lee, H. Depletion of Aurora-A in zebrafish causes growth retardation due to mitotic delay and p53-dependent cell death. FEBS J. 280 (6), 1518-1530 (2013).
- Jeong, K., Jeong, J. Y., Lee, H. O., Choi, E., Lee, H. Inhibition of Plk1 induces mitotic infidelity and embryonic growth defects in developing zebrafish embryos. Dev Biol. 345 (1), 34-48 (2010).
- Bonenfant, D., Coulot, M., Towbin, H., Schindler, P., van Oostrum, J. Characterization of histone H2A and H2B variants and their post-translational modifications by mass spectrometry. Mol Cell Proteomics. 5 (3), 541-552 (2006).
- Kwan, K. M., et al. A complex choreography of cell movements shapes the vertebrate eye. Development. 139 (2), 359-372 (2012).
- Pilaz, L. J., Silver, D. L. Live imaging of mitosis in the developing mouse embryonic cortex. J Vis Exp. (88), (2014).
- Davidson, G., et al. Casein kinase 1 gamma couples Wnt receptor activation to cytoplasmic signal transduction. Nature. 438 (7069), 867-872 (2005).
- Smith, R. M., et al. Exocytotic insertion of calcium channels constrains compensatory endocytosis to sites of exocytosis. J Cell Biol. 148 (4), 755-767 (2000).
- Reid, T. S., Terry, K. L., Casey, P. J., Beese, L. S. Crystallographic analysis of CaaX prenyltransferases complexed with substrates defines rules of protein substrate selectivity. J Mol Biol. 343 (2), 417-433 (2004).
- Gerlach, G. F., Morales, E. E., Wingert, R. A. Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo. J Vis Exp. (101), e52943 (2015).
- Porazinski, S. R., Wang, H., Furutani-Seiki, M. Microinjection of medaka embryos for use as a model genetic organism. J Vis Exp. (46), (2010).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
- Sugiyama, M., et al. Illuminating cell-cycle progression in the developing zebrafish embryo. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (49), 20812-20817 (2009).
- Ariga, J., Walker, S. L., Mumm, J. S. Multicolor time-lapse imaging of transgenic zebrafish: visualizing retinal stem cells activated by targeted neuronal cell ablation. J Vis Exp. (43), (2010).
- O’Brien, G. S., et al. Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos. J Vis Exp. (24), (2009).
- Maiato, H., Logarinho, E. Mitotic spindle multipolarity without centrosome amplification. Nat Cell Biol. 16 (5), 386-394 (2014).
- Gorbsky, G. J. Cohesion fatigue. Curr Biol. 23 (22), 986-988 (2013).
- Daum, J. R., et al. Cohesion fatigue induces chromatid separation in cells delayed at metaphase. Curr Biol. 21 (12), 1018-1024 (2011).
- Germann, S. M., et al. TopBP1/Dpb11 binds DNA anaphase bridges to prevent genome instability. J Cell Biol. 204 (1), 45-59 (2014).
- Chan, K. L., North, P. S., Hickson, I. D. BLM is required for faithful chromosome segregation and its localization defines a class of ultrafine anaphase bridges. EMBO J. 26 (14), 3397-3409 (2007).
- Wuhr, M., Obholzer, N. D., Megason, S. G., Detrich, H. W., Mitchison 3rd, ., J, T. Live imaging of the cytoskeleton in early cleavage-stage zebrafish embryos. Methods Cell Biol. 101, 1-18 (2011).
- Rogers, S. L., Rogers, G. C., Sharp, D. J., Vale, R. D. Drosophila EB1 is important for proper assembly, dynamics, and positioning of the mitotic spindle. J Cell Biol. 158 (5), 873-884 (2002).
- Gascoigne, K. E., Cheeseman, I. M. CDK-dependent phosphorylation and nuclear exclusion coordinately control kinetochore assembly state. J Cell Biol. 201 (1), 23-32 (2013).
- Scott, E. S., O’Hare, P. Fate of the inner nuclear membrane protein lamin B receptor and nuclear lamins in herpes simplex virus type 1 infection. J Virol. 75 (18), 8818-8830 (2001).
- Shankaran, S. S., Mackay, D. R., Ullman, K. S. A time-lapse imaging assay to study nuclear envelope breakdown. Methods Mol Biol. 931, 111-122 (2013).
- Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (34), 13904-13909 (2013).
- Irion, U., Krauss, J., Nusslein-Volhard, C. Precise and efficient genome editing in zebrafish using the CRISPR/Cas9 system. Development. 141 (24), 4827-4830 (2014).
- Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nat Biotechnol. 31 (3), 227-229 (2013).
- Hruscha, A., et al. Efficient CRISPR/Cas9 genome editing with low off-target effects in zebrafish. Development. 140 (24), 4982-4987 (2013).
- Thomas, H. R., Percival, S. M., Yoder, B. K., Parant, J. M. High-throughput genome editing and phenotyping facilitated by high resolution melting curve analysis. PLoS One. 9 (12), 114632 (2014).
