התבוננות mitotic חטיבת Dynamics בעובר דג הזברה לחיות
Summary
Mitosis is critical to every living organism and defects often lead to cancer and developmental disorders. Using this imaging protocol and zebrafish as a model system, researchers can visualize mitosis in a live vertebrate organism and the multitude of defects that arise when mitotic processes are defective.
Abstract
מיטוזה היא קריטית לצמיחה האורגניזם והבחנה. התהליך הוא מאוד דינמי ומחייב הורה אירועים להשיג עיבוי הכרומטין נכון, מצורף קינטוכור-microtubule, פרדה כרומוזום, ואת cytokinesis בתוך מסגרת זמן קטנה. שגיאות בתהליך העדין יכולות לגרום מחלות אנושיות, כוללים מומים מולדים וסרטן. גישות מסורתיות חוקרות מצבי מחל mitotic אדם לעתים קרובות מסתמכות על מערכות תרבית תאים, אשר חסרים את הפיסיולוגיה הטבעית בהקשר התפתחותי / רקמות ספציפיות יתרון כאשר לומדים מחלות אנושיות. פרוטוקול זה מתגבר על מכשולים רבים על ידי מתן דרך לחזות, עם רזולוציה גבוהה, דינמיקת כרומוזום במערכת החולייתנים, דג הזברה. פרוטוקול זה יפרט גישה, שניתן להשתמש בם כדי להשיג תמונות דינמיות של תאים מתחלקים, הכוללים: במבחנת שעתוק, רביית דג זברה / איסוף, הטבעה עוברת, ולאחר הזמן לשגות הדמיה. אופטימיזציה modifications של פרוטוקול זה גם נחקר. שימוש H2A.F / Z-EGFP (תוויות הכרומטין) ו mCherry-CAAX (קרום התא תוויות) עוברים מוזרק mRNA, מיטוזה ב AB wild-type, auroraB hi1045, ו hi2865 esco2 דג הזברה מוטציה הוא מדמיין. הדמיה לחיות ברזולוציה גבוהה של דג זברה מאפשרת להתבונן mitoses המרובה לכמת פגמי mitotic סטטיסטיים ועיתוי של התקדמות mitotic. בנוסף, תצפית של היבטים איכותיים המגדירים תהליכי mitotic פסולים (כלומר, פגמי congression, missegregation של כרומוזומים, וכו ') ותוצאות כרומוזומליות פסולות (כלומר, aneuploidy, polyploidy, גרעינונים, וכו') הם נצפו. assay זה יכול להיות מיושם על תצפית של / בידול רקמת פיתוח הוא נוח לשימוש דג הזברה מוטציה וסוכני תרופתי. ויזואליזציה של כמה פגמים מיטוזה להוביל להפרעות סרטן והתפתחותיות יהיה מאודלשפר את ההבנה של בפתוגנזה של המחלה.
Introduction
מיטוזה הוא חיוני בתהליכים תאיים קריטי לצמיחה, בידול, והתחדשות בכל יצור חי. עם הכנה מדויקת שכפול של דנ"א ביניים, התא ערוך לחלק. השלב הראשון של מיטוזה, prophase, הוא שיזם ההפעלה של cyclin B / Cdk1. Prophase מאופיין עיבוי של חומר הכרומטין לתוך הכרומוזומים. פירוט המעטפה גרעיני מתרחש במעבר בין prophase ו prometaphase. בשנת prometaphase, centrosomes, במרכז nucleating להיווצרות ציר, להתחיל להגר הקטבים תוך הארכת microtubules בחיפוש מצורף קינטוכור. עם קובץ מצורף, המרות קצה בדבר עיקול microtubule וכוחות המתח לכוון את הכרומוזומים להרכיב צלחת metaphase 1. אם כל הכרומוזומים מחוברים כהלכה, מחסום הרכבת הציר בא על סיפוקו, טבעות cohesin מחזיקות את כרומטידה האחות יחד הם בקעו, ו microtubules לקצר למשוך אחותוכרומטידה כדי קטבים מנוגדים במהלך anaphase 2,3. השלב הסופי, telophase, כרוך התארכות התא הרפורמציה של מעטפת הגרעין סביב שני הגרעינים החדשים. Cytokinesis משלים את התהליך החלוקה על ידי הפרדת הציטופלסמה של התאים הבת החדשים שני 4-6. שינוי מסלולי mitotic מפתח (כלומר, מחסום הרכבת ציר, שכפול centrosome, לכידות כרומטידה אחות, וכו.) יכול לגרום למעצר metaphase, missegregation של הכרומוזומים, 7-10 יציבות גנומית. בסופו של דבר, פגמי מיטוזה שליטת מסלולים יכולים לגרום פרעות התפתחותיות וסרטן, ויזואליזציה מחייב של מיטוזה והפגמים שלה חי, חוליות, רב תאי אורגניזם 10-16.
עוברי דג הזברה לשרת כאורגניזם מודל נהדר עבור הדמיה לחיות בשל רקמה שקופה, קלות microinjection, ופיתוח מהיר. שימוש דג זברה, המטרה הכוללת של כתב היד הזה היאמתארים שיטה של 5D חי (מידות X, Y, Z, זמן, אורך הגל) הדמיה של מיטוזה 17 (תרשים 1C). שימוש מוטצית דג הזברה פגומה במסלולי mitotic שונים להדגים התוצאה של פגמים כאלה. עבור פרוטוקול זה, מוטציות אורורה B ו- Esco2 נבחרו כדי להמחיש את הפגמים הללו. אורורה B הוא קינאז כי הוא חלק מקומפלקס נוסעים כרומוזום (CPC) המעורבים ביצירת ציר והתקשרות microtubule. היא נדרשת גם להיווצרות הקמט מחשוף ב cytokinesis 18,19. בשנת דג הזברה, מחסור ב אורורה מוביל פגמים אינדוקציה תלם, cytokinesis, וכרומוזום הפרדה 20. Esco2, ומצד שני, הוא acetyltransferase כי הוא חיוני עבור לכידות כרומטידה אחות 21,22. זה acetylates cohesin על החלק SMC3 של הטבעת ובכך מייצב cohesin כדי להבטיח הפרדה כרומוזום נכונה במעבר metaphase-anaphase 23. אובדן Esco2 דג הזברה מוביל CHmissegregation romosome, הפרדת כרומטידה אחות מוקדמת, חוסר יציבות גנומית, ו- p53 תלוי אפופטוזיס עצמאית 24,25. בשל הזמינות, auroraB hi1045, ו hi2865 esco2 דג הזברה מוטציה (להלן המכונה aurB מ / מ 'esco2 מ / מ', בהתאמה) ישמש כדי להמחיש את הטכניקה הזו 25-27.
מיקרוסקופיה זיווגי confocal עם מכונות תא ניאון מתויגות אפשרה לחוקרים לחזות דינמיקת הכרומטין קרום התא במהלך מיטוזה 25,28,29. פלורסנט מתויג היסטונים שימשו היסטורית לדמיין הכרומטין. ההיסטונים הם חלבונים גרעיניים מורכב מארבעה זוגות שונים (H2A, H2B, H3, H4 ו) כי הם אחראי המבנה הנוקלאוזום כי מלחינת כרומוזומים 30. בעוד H2B הוא לטעון את היסטון השימושי ביותר עבור חלבוני ניאון בהעכבר תרבית תאים, השימוש היסטון 2A, Z משפחה (H2A.F / Z) הוכיח גם לשימוש 31,32 דג הזברה. Concanavalin A ו- קזאין קינאז 1-גמא למשל, למקם את קרום התא בעבר הוכח יעיל לדמיין את קרום תא קיפודי ים תסיסנית 33,34. מחקרים אחרים הראו כי חלבון פלואורסצנטי מתויג CAAX תוויות קרום התא היה מוצלח דג זברה 31. CAAX הוא מוטיב כי הוא מוכר על ידי אנזימים שינוי שלאחר translational כגון farnesyltransferases ו geranylgeranyltransferases. שינויים על ידי אנזימים אלה לגרום חלבונים להפוך קרום קשור, ובכך תיוג קרום התא 35.
בשל השימוש לפני דג זברה, פרוטוקול זה בחר להשתמש H2A.F / ת ו CAAX לתייג הכרומטין קרום התא. יישום של שיטה זו יאפשר החוקר לפקח מיטוזה ברמת התא היחידה להתבונן כרומוזום פרטדינמיקה, וכן בו זמנית לפקח חלוקות תא מרובות עלולים להשפיע בידול רקמות ופיתוח. מאמר זה יתמקד הדמית הדינמיקה של פרדה כרומוזום במהלך מיטוזה ברמת התא היחידה. בתוך כתב היד הזה, את היכולת להתבונן כמה חטיבות mitotic, לחשב זמן חלוק, ולפענח פנוטיפים mitotic שתודגם ודנה. באמצעות פרמטרים אלה, נתונים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית ניתן לאסוף להחיל מצבי מחלה כמה מושפע פגמים mitotic.
Protocol
Representative Results
Discussion
השימוש בשיטה זו מאפשר להסיק פירוט מעטפת הגרעין, היווצרות של צלחת metaphase ידי קבצים מצורפים microtubule-קינטוכור, והפרדה של כרומטידה אחות ליצירת שני תאים חדשים vivo ובאופן שהזמן גרמן. היכולת להתבונן מיטוזה דג הזברה יש יתרון על פני דגימות קבועות ומערכות תרבית תאים כי ה…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Kristen Kwan for the pCS2-H2A.F/Z-EGFP and pCS2-mCherry-CAAX vectors. We thank Chris Rodesch for tutoring us in live imaging in zebrafish. We thank Shawn Williams, Erik Malarkey and Brad Yoder for assistance in confocal imaging at UAB and the High Resolution Imaging Facility at UAB. The High Resolution Imaging Facility is supported by the UAB Comprehensive Cancer Center Support Grant (P30CA013148) and the Rheumatic Disease Core Center (P30 AR048311). J.M.P. is supported by the National Institute of Neurological Disease and Stroke (NIH R21 NS092105), and pilot grants from American Cancer Society (ACS IRG-60-001-53-IRG) and the UAB Comprehensive Cancer Center (P30CA013148). S.M.P. is supported by the Cell and Molecular Biology T32 Training Grant (5T32GM008111-28).
Materials
| pCS2 vectors | Gift from K. Kwan | For plasmid of interest | |
| NotI-HF restriction enzyme | New England BioLabs | R3189S | For restriction digest of plasmid |
| mMessage SP6 kit | Life Technologies | AM1340 | For in vitro transcription |
| RNeasy Mini kit | Qiagen | 74104 | For purifying mRNA |
| 100 x 15 mm petri dishes | Fisher Scientific | FB0875712 | For housing embryos |
| microinjection mold | homemade | For holding embryos during microinjection | |
| Agarose II | Amresco | 0815-25G | For embedding embryos |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521-10G | For anesthetizing embryos |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| Calcium Chloride Dihydrate | Sigma-Aldrich | C8106 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| Magnesium Sulfate | Fisher Scientific | M7506 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| Methylene Blue Hydrate | Sigma-Aldrich | MB1 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| 100 mm culture tube | Fisher Scientific | 50-819-812 | For melted agar |
| 35 mm glass coverslip bottom culture dish | MatTek Corp | P35G-0-20-C | No. 0, 20 mm glass, For embedding embryos |
| #5 tweezers | Dumont | 72701-D | For dechorionating embryos |
| 21G 1 1/2 gauge needle | Becton Dickinson | 305167 | For positioning embryos in agar |
| Dissecting microscope | Nikon AZ100 | For screening and embedding embryos, any dissecting scope will do | |
| Confocal microscope | Nikon A1+ | For time-lapse imaging | |
| Confocal software | NIS Elements AR 4.13.00 | For image acquisition and processing |
References
- Musacchio, A., Hardwick, K. G. The spindle checkpoint: structural insights into dynamic signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (10), 731-741 (2002).
- Li, X., Nicklas, R. B. Mitotic forces control a cell-cycle checkpoint. Nature. 373 (6515), 630-632 (1995).
- Rieder, C. L., Cole, R. W., Khodjakov, A., Sluder, G. The checkpoint delaying anaphase in response to chromosome monoorientation is mediated by an inhibitory signal produced by unattached kinetochores. J Cell Biol. 130 (4), 941-948 (1995).
- Hayles, J., Nurse, P. A review of mitosis in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Exp Cell Res. 184 (2), 273-286 (1989).
- Pederson, T. Historical review: an energy reservoir for mitosis, and its productive wake. Trends Biochem Sci. 28 (3), 125-129 (2003).
- Sobel, S. G. Mini review: mitosis and the spindle pole body in Saccharomyces cerevisiae. J Exp Zool. 277 (2), 120-138 (1997).
- Thompson, S. L., Compton, D. A. Chromosome missegregation in human cells arises through specific types of kinetochore-microtubule attachment errors. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (44), 17974-17978 (2011).
- Duijf, P. H., Benezra, R. The cancer biology of whole-chromosome instability. Oncogene. 32 (40), 4727-4736 (2013).
- Lara-Gonzalez, P., Taylor, S. S. Cohesion fatigue explains why pharmacological inhibition of the APC/C induces a spindle checkpoint-dependent mitotic arrest. PLoS One. 7 (11), 49041 (2012).
- Araujo, A., Baum, B., Bentley, P. The role of chromosome missegregation in cancer development: a theoretical approach using agent-based modelling. PLoS One. 8 (8), 72206 (2013).
- Deardorff, M. A., et al. HDAC8 mutations in Cornelia de Lange syndrome affect the cohesin acetylation cycle. Nature. 489 (7415), 313-317 (2012).
- Chetaille, P., et al. Mutations in SGOL1 cause a novel cohesinopathy affecting heart and gut rhythm. Nat Genet. 46 (11), 1245-1249 (2014).
- Kaiser, F. J., et al. Loss-of-function HDAC8 mutations cause a phenotypic spectrum of Cornelia de Lange syndrome-like features, ocular hypertelorism, large fontanelle and X-linked inheritance. Hum Mol Genet. 23 (11), 2888-2900 (2014).
- Snape, K., et al. Mutations in CEP57 cause mosaic variegated aneuploidy syndrome. Nat Genet. 43 (6), 527-529 (2011).
- Suijkerbuijk, S. J., et al. Molecular causes for BUBR1 dysfunction in the human cancer predisposition syndrome mosaic variegated aneuploidy. Cancer Res. 70 (12), 4891-4900 (2010).
- Vega, H., et al. Roberts syndrome is caused by mutations in ESCO2, a human homolog of yeast ECO1 that is essential for the establishment of sister chromatid cohesion. Nat Genet. 37 (5), 468-470 (2005).
- Andrews, P. D., Harper, I. S., Swedlow, J. R. To 5D and beyond: quantitative fluorescence microscopy in the postgenomic era. Traffic. 3 (1), 29-36 (2002).
- Nigg, E. A. Mitotic kinases as regulators of cell division and its checkpoints. Nat Rev Mol Cell Biol. 2 (1), 21-32 (2001).
- Carlton, J. G., Caballe, A., Agromayor, M., Kloc, M., Martin-Serrano, J. ESCRT-III governs the Aurora B-mediated abscission checkpoint through CHMP4C. Science. 336 (6078), 220-225 (2012).
- Yabe, T., et al. The maternal-effect gene cellular island encodes aurora B kinase and is essential for furrow formation in the early zebrafish embryo. PLoS Genet. 5 (6), 1000518 (2009).
- Hou, F., Zou, H. Two human orthologues of Eco1/Ctf7 acetyltransferases are both required for proper sister-chromatid cohesion. Mol Biol Cell. 16 (8), 3908-3918 (2005).
- Ivanov, D., et al. Eco1 is a novel acetyltransferase that can acetylate proteins involved in cohesion. Curr Biol. 12 (4), 323-328 (2002).
- Beckouet, F., et al. An Smc3 acetylation cycle is essential for establishment of sister chromatid cohesion. Mol Cell. 39 (5), 689-699 (2010).
- Monnich, M., Kuriger, Z., Print, C. G., Horsfield, J. A. A zebrafish model of Roberts syndrome reveals that Esco2 depletion interferes with development by disrupting the cell cycle. PLoS One. 6 (5), 20051 (2011).
- Percival, S. M., et al. Variations in dysfunction of sister chromatid cohesion in esco2 mutant zebrafish reflect the phenotypic diversity of Roberts syndrome. Dis Model Mech. 8 (8), 941-955 (2015).
- Amsterdam, A., Hopkins, N. Retroviral-mediated insertional mutagenesis in zebrafish. Methods Cell Biol. 77, 3-20 (2004).
- Amsterdam, A., et al. Identification of 315 genes essential for early zebrafish development. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (35), 12792-12797 (2004).
- Jeon, H. Y., Lee, H. Depletion of Aurora-A in zebrafish causes growth retardation due to mitotic delay and p53-dependent cell death. FEBS J. 280 (6), 1518-1530 (2013).
- Jeong, K., Jeong, J. Y., Lee, H. O., Choi, E., Lee, H. Inhibition of Plk1 induces mitotic infidelity and embryonic growth defects in developing zebrafish embryos. Dev Biol. 345 (1), 34-48 (2010).
- Bonenfant, D., Coulot, M., Towbin, H., Schindler, P., van Oostrum, J. Characterization of histone H2A and H2B variants and their post-translational modifications by mass spectrometry. Mol Cell Proteomics. 5 (3), 541-552 (2006).
- Kwan, K. M., et al. A complex choreography of cell movements shapes the vertebrate eye. Development. 139 (2), 359-372 (2012).
- Pilaz, L. J., Silver, D. L. Live imaging of mitosis in the developing mouse embryonic cortex. J Vis Exp. (88), (2014).
- Davidson, G., et al. Casein kinase 1 gamma couples Wnt receptor activation to cytoplasmic signal transduction. Nature. 438 (7069), 867-872 (2005).
- Smith, R. M., et al. Exocytotic insertion of calcium channels constrains compensatory endocytosis to sites of exocytosis. J Cell Biol. 148 (4), 755-767 (2000).
- Reid, T. S., Terry, K. L., Casey, P. J., Beese, L. S. Crystallographic analysis of CaaX prenyltransferases complexed with substrates defines rules of protein substrate selectivity. J Mol Biol. 343 (2), 417-433 (2004).
- Gerlach, G. F., Morales, E. E., Wingert, R. A. Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo. J Vis Exp. (101), e52943 (2015).
- Porazinski, S. R., Wang, H., Furutani-Seiki, M. Microinjection of medaka embryos for use as a model genetic organism. J Vis Exp. (46), (2010).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
- Sugiyama, M., et al. Illuminating cell-cycle progression in the developing zebrafish embryo. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (49), 20812-20817 (2009).
- Ariga, J., Walker, S. L., Mumm, J. S. Multicolor time-lapse imaging of transgenic zebrafish: visualizing retinal stem cells activated by targeted neuronal cell ablation. J Vis Exp. (43), (2010).
- O’Brien, G. S., et al. Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos. J Vis Exp. (24), (2009).
- Maiato, H., Logarinho, E. Mitotic spindle multipolarity without centrosome amplification. Nat Cell Biol. 16 (5), 386-394 (2014).
- Gorbsky, G. J. Cohesion fatigue. Curr Biol. 23 (22), 986-988 (2013).
- Daum, J. R., et al. Cohesion fatigue induces chromatid separation in cells delayed at metaphase. Curr Biol. 21 (12), 1018-1024 (2011).
- Germann, S. M., et al. TopBP1/Dpb11 binds DNA anaphase bridges to prevent genome instability. J Cell Biol. 204 (1), 45-59 (2014).
- Chan, K. L., North, P. S., Hickson, I. D. BLM is required for faithful chromosome segregation and its localization defines a class of ultrafine anaphase bridges. EMBO J. 26 (14), 3397-3409 (2007).
- Wuhr, M., Obholzer, N. D., Megason, S. G., Detrich, H. W., Mitchison 3rd, ., J, T. Live imaging of the cytoskeleton in early cleavage-stage zebrafish embryos. Methods Cell Biol. 101, 1-18 (2011).
- Rogers, S. L., Rogers, G. C., Sharp, D. J., Vale, R. D. Drosophila EB1 is important for proper assembly, dynamics, and positioning of the mitotic spindle. J Cell Biol. 158 (5), 873-884 (2002).
- Gascoigne, K. E., Cheeseman, I. M. CDK-dependent phosphorylation and nuclear exclusion coordinately control kinetochore assembly state. J Cell Biol. 201 (1), 23-32 (2013).
- Scott, E. S., O’Hare, P. Fate of the inner nuclear membrane protein lamin B receptor and nuclear lamins in herpes simplex virus type 1 infection. J Virol. 75 (18), 8818-8830 (2001).
- Shankaran, S. S., Mackay, D. R., Ullman, K. S. A time-lapse imaging assay to study nuclear envelope breakdown. Methods Mol Biol. 931, 111-122 (2013).
- Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (34), 13904-13909 (2013).
- Irion, U., Krauss, J., Nusslein-Volhard, C. Precise and efficient genome editing in zebrafish using the CRISPR/Cas9 system. Development. 141 (24), 4827-4830 (2014).
- Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nat Biotechnol. 31 (3), 227-229 (2013).
- Hruscha, A., et al. Efficient CRISPR/Cas9 genome editing with low off-target effects in zebrafish. Development. 140 (24), 4982-4987 (2013).
- Thomas, H. R., Percival, S. M., Yoder, B. K., Parant, J. M. High-throughput genome editing and phenotyping facilitated by high resolution melting curve analysis. PLoS One. 9 (12), 114632 (2014).
