Observation Mitotisk Division og Dynamics i en Live zebrafisk Embryo
Summary
Mitosis is critical to every living organism and defects often lead to cancer and developmental disorders. Using this imaging protocol and zebrafish as a model system, researchers can visualize mitosis in a live vertebrate organism and the multitude of defects that arise when mitotic processes are defective.
Abstract
Mitose er kritisk for organismal vækst og differentiering. Processen er meget dynamisk og kræver beordret begivenheder til at udføre korrekt kromatin kondensering, mikrotubuli-kinetochore vedhæftet fil, kromosom adskillelse, og cytokinese i en lille tidsramme. Fejl i vanskelige proces kan resultere i human sygdom, herunder fosterskader og kræft. Traditionelle tilgange undersøger menneskelige mitotisk sygdomstilstande ofte afhængige cellekultursystemer, som mangler den naturlige fysiologi og udviklingsmæssige / væv-specifikke kontekst fordelagtig, når studerer human sygdom. Denne protokol overvinder mange forhindringer ved at give en måde at visualisere, med høj opløsning, kromosom dynamik i et hvirveldyr system, zebrafisk. Denne protokol vil detalje en tilgang, der kan bruges til at opnå dynamiske billeder af delende celler, som omfatter: in vitro-transskription, zebrafisk avl / indsamling, embryo indlejring og time-lapse billeddannelse. Optimering og modifaf tekniske data i denne protokol er også undersøgt. Brug af H2A.F / Z-EGFP (etiketter chromatin) og mCherry-CAAX (etiketter cellemembran) mRNA-injicerede embryoner, mitose i AB vildtype, auroraB hi1045, og esco2 hi2865 mutant zebrafisk visualiseres. Høj opløsning levende billedbehandling i zebrafisk tillader en at observere flere mitose til statistisk kvantificere mitotiske fejl og timingen af mitotisk progression. Desuden er observation af kvalitative aspekter, der definerer upassende mitoseprocesser (dvs. kongression defekter, missegregation af kromosomer, etc.) og forkert kromosomale udfald (dvs. aneuploidi, polyploidi, mikrokerner, etc.) overholdes. Dette assay kan anvendes til observation af vævsdifferentiering / udvikling og kan underkastes anvendelsen af mutant zebrafisk og farmakologiske midler. Visualisering af, hvordan fejl i mitose føre til kræft og udviklingsmæssige forstyrrelser vil i høj gradøge forståelsen af patogenesen af sygdommen.
Introduction
Mitose er en kritisk cellulær proces essentielle for vækst, differentiering og regenerering i en levende organisme. Efter nøjagtig tilberedning og replikation af DNA i interfasen, er cellen klargøres til at dele sig. Den første fase af mitose, profase, initieres ved aktivering af cyklin B / Cdk1. Profase er kendetegnet ved kondensation af kromatin materiale i kromosomer. opdeling nuklear kappe forekommer ved overgangen mellem profase og prometafasen. I prometafasen, centrosomer, den kimdannende center for spindel dannelse, begynder at migrere til modsatte poler samtidig udvide mikrotubuli i jagten på kinetochore vedhæftet fil. Ved fastgørelse, til konverteringer end-på mikrotubuli udlæg og trækkræfter orientere kromosomerne danner en metafaseplade 1. Hvis alle kromosomer er tilsluttet korrekt, er spindlen samling checkpoint tilfredse, cohesin ringe holder søster kromatider sammen spaltes, og mikrotubuli forkorte at trække søsterkromatider til modsatte poler under anafase 2,3. Den sidste fase, telofase, involverer forlængelse af cellen og gendannelse af nuklear kappe omkring de to nye kerner. Cytokinese fuldender division processen ved at adskille cytoplasmaet af de to nye datterceller 4-6. Ændring af centrale mitotiske veje (dvs. spindel samling checkpoint, centrosom dobbeltarbejde, søsterkromatid samhørighed, osv.) Kan resultere i metafase anholdelse, missegregation af kromosomer, og genomisk instabilitet 7-10. I sidste ende kan defekter i veje kontrollerende mitose forårsage udviklingsforstyrrelser og kræft, hvilket nødvendiggør visualisering af mitose og dets defekter i en levende, hvirveldyr, multi-cellulære organisme 10-16.
Zebrafisk embryoner tjene som en stor model organisme for levende billeddannelse på grund af den gennemsigtige væv, nem mikroinjektion og hurtig udvikling. Brug zebrafisk, det overordnede mål med dette manuskript er atbeskriver en fremgangsmåde til levende 5D (dimensioner X, Y, Z, tid og bølgelængde) afbildning af mitose 17 (figur 1C). Brugen af mutant zebrafisk defekt i forskellige mitotiske veje demonstrerer følge af sådanne defekter. Til denne protokol blev Aurora B og Esco2 mutanter valgt at illustrere disse defekter. Aurora B er en kinase, der er en del af kromosomet passager kompleks (CPC) involveret i spindeldannelse og mikrotubulus vedhæftet fil. Det er også nødvendigt for spaltning fure dannelse i cytokinese 18,19. I zebrafisk, Aurora B-mangel fører til fejl i fure induktion, cytokinese, og kromosom segregation 20. Esco2, på den anden side, er en acetyltransferase som er essentielt for søsterkromatid samhørighed 21,22. Det acetylerer cohesin på SMC3 del af ringen dermed stabiliserer cohesin at sikre korrekt kromosom adskillelse ved metafase-anafase overgangen 23. Tab af Esco2 i zebrafisk fører til chromosome missegregation, for tidlig søsterkromatid separation, genomisk ustabilitet, og p53-afhængig og uafhængig apoptose 24,25. På grund af tilgængeligheden, auroraB hi1045, og esco2 hi2865 mutant zebrafisk (i det følgende benævnt Aurb m / m og esco2 m / m, henholdsvis), vil blive brugt til at illustrere denne teknik 25-27.
Kobling konfokal mikroskopi med fluorescerende-mærket celle maskiner har gjort det muligt for forskerne at visualisere kromatin og cellemembran dynamik under mitose 25,28,29. Fluorescerende-mærkede histoner historisk har været anvendt til at visualisere kromatin. Histoner er nukleare proteiner er sammensat af fire forskellige par (H2A, H2B, H3 og H4), der er ansvarlige for nukleosom struktur, der komponerer kromosomer 30. Mens H2B er nok den mest brugte histon for fluorescerende proteiner imus og cellekultur, brug af histon 2A, Familie Z (H2A.F / Z) har vist sig godt til brug i zebrafisk 31,32. Concanavalin A og casein-kinase 1-gamma f.eks lokalisere til cellemembranen og har tidligere vist sig effektiv til at visualisere cellemembranen i søpindsvin og drosophila 33,34. Andre undersøgelser har vist, at CAAX fluorescerende-mærket protein etiketter cellemembranen og havde succes med zebrafisk 31. CAAX er et motiv, der er anerkendt af posttranslationelle modificerende enzymer såsom farnesyltransferases og geranylgeranyltransferases. Modifikationer af disse enzymer forårsager proteiner til at blive membranassocieret, således mærkning cellemembranen 35.
På grund af den tidligere brug i zebrafisk, denne protokol valgte at bruge H2A.F / Z og CAAX at mærke kromatin og cellemembranen. Anvendelse af denne metode vil gøre det muligt for forskeren at overvåge mitose på det individuelle celleniveau at observere individuelle kromosomdynamik, såvel som samtidig overvåge flere celledelinger, der kan påvirke vævsdifferentiering og udvikling. Denne artikel vil fokusere på billeddannelse dynamikken i kromosom adskillelse under mitose på den enkelte celle niveau. Inden dette manuskript, vil evnen til at observere flere mitotiske divisioner, beregne division tid, og dechifrere de mitotiske fænotyper illustreres og diskuteres. Ved at bruge disse parametre, fysiologisk relevante data kan indsamles og anvendes på flere sygdomstilstande ramt af mitotiske defekter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Anvendelse af denne fremgangsmåde tillader en at udlede fordelingen nuklear kappe, dannelse af en metafaseplade af mikrotubulus-kinetochore vedhæftninger, og adskillelse af søsterchromatider at danne to nye celler in vivo og in en tidsafhængig måde. Evnen til at iagttage mitose i zebrafisk er fordelagtig i forhold faste prøver og cellekultursystemer fordi cellerne, der afbildes i uforarbejdet fysiologi, vævet er transparent, som giver mulighed for fluorescerende proteiner, der skal anvendes, de udvikler …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Kristen Kwan for the pCS2-H2A.F/Z-EGFP and pCS2-mCherry-CAAX vectors. We thank Chris Rodesch for tutoring us in live imaging in zebrafish. We thank Shawn Williams, Erik Malarkey and Brad Yoder for assistance in confocal imaging at UAB and the High Resolution Imaging Facility at UAB. The High Resolution Imaging Facility is supported by the UAB Comprehensive Cancer Center Support Grant (P30CA013148) and the Rheumatic Disease Core Center (P30 AR048311). J.M.P. is supported by the National Institute of Neurological Disease and Stroke (NIH R21 NS092105), and pilot grants from American Cancer Society (ACS IRG-60-001-53-IRG) and the UAB Comprehensive Cancer Center (P30CA013148). S.M.P. is supported by the Cell and Molecular Biology T32 Training Grant (5T32GM008111-28).
Materials
| pCS2 vectors | Gift from K. Kwan | For plasmid of interest | |
| NotI-HF restriction enzyme | New England BioLabs | R3189S | For restriction digest of plasmid |
| mMessage SP6 kit | Life Technologies | AM1340 | For in vitro transcription |
| RNeasy Mini kit | Qiagen | 74104 | For purifying mRNA |
| 100 x 15 mm petri dishes | Fisher Scientific | FB0875712 | For housing embryos |
| microinjection mold | homemade | For holding embryos during microinjection | |
| Agarose II | Amresco | 0815-25G | For embedding embryos |
| Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521-10G | For anesthetizing embryos |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| Calcium Chloride Dihydrate | Sigma-Aldrich | C8106 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| Magnesium Sulfate | Fisher Scientific | M7506 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| Methylene Blue Hydrate | Sigma-Aldrich | MB1 | For embryo water (E3 Blue), dissolved in UltraPure H2O |
| 100 mm culture tube | Fisher Scientific | 50-819-812 | For melted agar |
| 35 mm glass coverslip bottom culture dish | MatTek Corp | P35G-0-20-C | No. 0, 20 mm glass, For embedding embryos |
| #5 tweezers | Dumont | 72701-D | For dechorionating embryos |
| 21G 1 1/2 gauge needle | Becton Dickinson | 305167 | For positioning embryos in agar |
| Dissecting microscope | Nikon AZ100 | For screening and embedding embryos, any dissecting scope will do | |
| Confocal microscope | Nikon A1+ | For time-lapse imaging | |
| Confocal software | NIS Elements AR 4.13.00 | For image acquisition and processing |
References
- Musacchio, A., Hardwick, K. G. The spindle checkpoint: structural insights into dynamic signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (10), 731-741 (2002).
- Li, X., Nicklas, R. B. Mitotic forces control a cell-cycle checkpoint. Nature. 373 (6515), 630-632 (1995).
- Rieder, C. L., Cole, R. W., Khodjakov, A., Sluder, G. The checkpoint delaying anaphase in response to chromosome monoorientation is mediated by an inhibitory signal produced by unattached kinetochores. J Cell Biol. 130 (4), 941-948 (1995).
- Hayles, J., Nurse, P. A review of mitosis in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Exp Cell Res. 184 (2), 273-286 (1989).
- Pederson, T. Historical review: an energy reservoir for mitosis, and its productive wake. Trends Biochem Sci. 28 (3), 125-129 (2003).
- Sobel, S. G. Mini review: mitosis and the spindle pole body in Saccharomyces cerevisiae. J Exp Zool. 277 (2), 120-138 (1997).
- Thompson, S. L., Compton, D. A. Chromosome missegregation in human cells arises through specific types of kinetochore-microtubule attachment errors. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (44), 17974-17978 (2011).
- Duijf, P. H., Benezra, R. The cancer biology of whole-chromosome instability. Oncogene. 32 (40), 4727-4736 (2013).
- Lara-Gonzalez, P., Taylor, S. S. Cohesion fatigue explains why pharmacological inhibition of the APC/C induces a spindle checkpoint-dependent mitotic arrest. PLoS One. 7 (11), 49041 (2012).
- Araujo, A., Baum, B., Bentley, P. The role of chromosome missegregation in cancer development: a theoretical approach using agent-based modelling. PLoS One. 8 (8), 72206 (2013).
- Deardorff, M. A., et al. HDAC8 mutations in Cornelia de Lange syndrome affect the cohesin acetylation cycle. Nature. 489 (7415), 313-317 (2012).
- Chetaille, P., et al. Mutations in SGOL1 cause a novel cohesinopathy affecting heart and gut rhythm. Nat Genet. 46 (11), 1245-1249 (2014).
- Kaiser, F. J., et al. Loss-of-function HDAC8 mutations cause a phenotypic spectrum of Cornelia de Lange syndrome-like features, ocular hypertelorism, large fontanelle and X-linked inheritance. Hum Mol Genet. 23 (11), 2888-2900 (2014).
- Snape, K., et al. Mutations in CEP57 cause mosaic variegated aneuploidy syndrome. Nat Genet. 43 (6), 527-529 (2011).
- Suijkerbuijk, S. J., et al. Molecular causes for BUBR1 dysfunction in the human cancer predisposition syndrome mosaic variegated aneuploidy. Cancer Res. 70 (12), 4891-4900 (2010).
- Vega, H., et al. Roberts syndrome is caused by mutations in ESCO2, a human homolog of yeast ECO1 that is essential for the establishment of sister chromatid cohesion. Nat Genet. 37 (5), 468-470 (2005).
- Andrews, P. D., Harper, I. S., Swedlow, J. R. To 5D and beyond: quantitative fluorescence microscopy in the postgenomic era. Traffic. 3 (1), 29-36 (2002).
- Nigg, E. A. Mitotic kinases as regulators of cell division and its checkpoints. Nat Rev Mol Cell Biol. 2 (1), 21-32 (2001).
- Carlton, J. G., Caballe, A., Agromayor, M., Kloc, M., Martin-Serrano, J. ESCRT-III governs the Aurora B-mediated abscission checkpoint through CHMP4C. Science. 336 (6078), 220-225 (2012).
- Yabe, T., et al. The maternal-effect gene cellular island encodes aurora B kinase and is essential for furrow formation in the early zebrafish embryo. PLoS Genet. 5 (6), 1000518 (2009).
- Hou, F., Zou, H. Two human orthologues of Eco1/Ctf7 acetyltransferases are both required for proper sister-chromatid cohesion. Mol Biol Cell. 16 (8), 3908-3918 (2005).
- Ivanov, D., et al. Eco1 is a novel acetyltransferase that can acetylate proteins involved in cohesion. Curr Biol. 12 (4), 323-328 (2002).
- Beckouet, F., et al. An Smc3 acetylation cycle is essential for establishment of sister chromatid cohesion. Mol Cell. 39 (5), 689-699 (2010).
- Monnich, M., Kuriger, Z., Print, C. G., Horsfield, J. A. A zebrafish model of Roberts syndrome reveals that Esco2 depletion interferes with development by disrupting the cell cycle. PLoS One. 6 (5), 20051 (2011).
- Percival, S. M., et al. Variations in dysfunction of sister chromatid cohesion in esco2 mutant zebrafish reflect the phenotypic diversity of Roberts syndrome. Dis Model Mech. 8 (8), 941-955 (2015).
- Amsterdam, A., Hopkins, N. Retroviral-mediated insertional mutagenesis in zebrafish. Methods Cell Biol. 77, 3-20 (2004).
- Amsterdam, A., et al. Identification of 315 genes essential for early zebrafish development. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (35), 12792-12797 (2004).
- Jeon, H. Y., Lee, H. Depletion of Aurora-A in zebrafish causes growth retardation due to mitotic delay and p53-dependent cell death. FEBS J. 280 (6), 1518-1530 (2013).
- Jeong, K., Jeong, J. Y., Lee, H. O., Choi, E., Lee, H. Inhibition of Plk1 induces mitotic infidelity and embryonic growth defects in developing zebrafish embryos. Dev Biol. 345 (1), 34-48 (2010).
- Bonenfant, D., Coulot, M., Towbin, H., Schindler, P., van Oostrum, J. Characterization of histone H2A and H2B variants and their post-translational modifications by mass spectrometry. Mol Cell Proteomics. 5 (3), 541-552 (2006).
- Kwan, K. M., et al. A complex choreography of cell movements shapes the vertebrate eye. Development. 139 (2), 359-372 (2012).
- Pilaz, L. J., Silver, D. L. Live imaging of mitosis in the developing mouse embryonic cortex. J Vis Exp. (88), (2014).
- Davidson, G., et al. Casein kinase 1 gamma couples Wnt receptor activation to cytoplasmic signal transduction. Nature. 438 (7069), 867-872 (2005).
- Smith, R. M., et al. Exocytotic insertion of calcium channels constrains compensatory endocytosis to sites of exocytosis. J Cell Biol. 148 (4), 755-767 (2000).
- Reid, T. S., Terry, K. L., Casey, P. J., Beese, L. S. Crystallographic analysis of CaaX prenyltransferases complexed with substrates defines rules of protein substrate selectivity. J Mol Biol. 343 (2), 417-433 (2004).
- Gerlach, G. F., Morales, E. E., Wingert, R. A. Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo. J Vis Exp. (101), e52943 (2015).
- Porazinski, S. R., Wang, H., Furutani-Seiki, M. Microinjection of medaka embryos for use as a model genetic organism. J Vis Exp. (46), (2010).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
- Sugiyama, M., et al. Illuminating cell-cycle progression in the developing zebrafish embryo. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (49), 20812-20817 (2009).
- Ariga, J., Walker, S. L., Mumm, J. S. Multicolor time-lapse imaging of transgenic zebrafish: visualizing retinal stem cells activated by targeted neuronal cell ablation. J Vis Exp. (43), (2010).
- O’Brien, G. S., et al. Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos. J Vis Exp. (24), (2009).
- Maiato, H., Logarinho, E. Mitotic spindle multipolarity without centrosome amplification. Nat Cell Biol. 16 (5), 386-394 (2014).
- Gorbsky, G. J. Cohesion fatigue. Curr Biol. 23 (22), 986-988 (2013).
- Daum, J. R., et al. Cohesion fatigue induces chromatid separation in cells delayed at metaphase. Curr Biol. 21 (12), 1018-1024 (2011).
- Germann, S. M., et al. TopBP1/Dpb11 binds DNA anaphase bridges to prevent genome instability. J Cell Biol. 204 (1), 45-59 (2014).
- Chan, K. L., North, P. S., Hickson, I. D. BLM is required for faithful chromosome segregation and its localization defines a class of ultrafine anaphase bridges. EMBO J. 26 (14), 3397-3409 (2007).
- Wuhr, M., Obholzer, N. D., Megason, S. G., Detrich, H. W., Mitchison 3rd, ., J, T. Live imaging of the cytoskeleton in early cleavage-stage zebrafish embryos. Methods Cell Biol. 101, 1-18 (2011).
- Rogers, S. L., Rogers, G. C., Sharp, D. J., Vale, R. D. Drosophila EB1 is important for proper assembly, dynamics, and positioning of the mitotic spindle. J Cell Biol. 158 (5), 873-884 (2002).
- Gascoigne, K. E., Cheeseman, I. M. CDK-dependent phosphorylation and nuclear exclusion coordinately control kinetochore assembly state. J Cell Biol. 201 (1), 23-32 (2013).
- Scott, E. S., O’Hare, P. Fate of the inner nuclear membrane protein lamin B receptor and nuclear lamins in herpes simplex virus type 1 infection. J Virol. 75 (18), 8818-8830 (2001).
- Shankaran, S. S., Mackay, D. R., Ullman, K. S. A time-lapse imaging assay to study nuclear envelope breakdown. Methods Mol Biol. 931, 111-122 (2013).
- Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (34), 13904-13909 (2013).
- Irion, U., Krauss, J., Nusslein-Volhard, C. Precise and efficient genome editing in zebrafish using the CRISPR/Cas9 system. Development. 141 (24), 4827-4830 (2014).
- Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nat Biotechnol. 31 (3), 227-229 (2013).
- Hruscha, A., et al. Efficient CRISPR/Cas9 genome editing with low off-target effects in zebrafish. Development. 140 (24), 4982-4987 (2013).
- Thomas, H. R., Percival, S. M., Yoder, B. K., Parant, J. M. High-throughput genome editing and phenotyping facilitated by high resolution melting curve analysis. PLoS One. 9 (12), 114632 (2014).
