Методы эволюции Robust пентозы брожения дрожжей для биоконверсии лигноцеллюлозы к этанолу
Summary
Адаптивные методы эволюции и изоляции описаны и продемонстрированы с получением производных Scheffersomyces stipitis штамма NRRL Y-7124, которые способны быстро потреблять гексозы и пентозы смешанных сахаров в фермента осахаривают undetoxified гидролизатов и аккумулировать более 40 г / л этанола.
Abstract
Lignocellulosic biomass is an abundant, renewable feedstock useful for production of fuel-grade ethanol and other bio-products. Pretreatment and enzyme saccharification processes release sugars that can be fermented by yeast. Traditional industrial yeasts do not ferment xylose (comprising up to 40% of plant sugars) and are not able to function in concentrated hydrolyzates. Concentrated hydrolyzates are needed to support economical ethanol recovery, but they are laden with toxic byproducts generated during pretreatment. While detoxification methods can render hydrolyzates fermentable, they are costly and generate waste disposal liabilities. Here, adaptive evolution and isolation techniques are described and demonstrated to yield derivatives of the native Scheffersomyces stipitis strain NRRL Y-7124 that are able to efficiently convert hydrolyzates to economically recoverable ethanol despite adverse culture conditions. Improved individuals are enriched in an evolving population using multiple selection pressures reliant on natural genetic diversity of the S. stipitis population and mutations induced by exposures to two diverse hydrolyzates, ethanol or UV radiation. Final evolution cultures are dilution plated to harvest predominant isolates, while intermediate populations, frozen in glycerol at various stages of evolution, are enriched on selective media using appropriate stress gradients to recover most promising isolates through dilution plating. Isolates are screened on various hydrolyzate types and ranked using a novel procedure involving dimensionless relative performance index (RPI) transformations of the xylose uptake rate and ethanol yield data. Using the RPI statistical parameter, an overall relative performance average is calculated to rank isolates based on multiple factors, including culture conditions (varying in nutrients and inhibitors) and kinetic characteristics. Through application of these techniques, derivatives of the parent strain had the following improved features in enzyme saccharified hydrolyzates at pH 5-6: reduced initial lag phase preceding growth, reduced diauxic lag during glucose-xylose transition, significantly enhanced fermentation rates, improved ethanol tolerance and accumulation to 40 g/L.
Introduction
По оценкам , ежегодные 1,3 млрд сухих тонн биомассы лигноцеллюлозы может поддержать производство этанола и позволит США сократить потребление нефти на 30%. 1 Хотя биомасса растений урожайность гидролиза сахара смеси , богатые глюкозы и ксилозы, ингибиторы брожения генерируются предварительной химической обработки , необходимой чтобы сломать гемицеллюлозы и подвергать целлюлозу ферментной атаке. Уксусная кислота, фурфурол и оксиметилфурфурола (HMF), как полагают, являются ключевыми компонентами среди многих ингибиторов, которые формируют во время предварительной обработки. Для того чтобы переместить лигноцеллюлозного производство этанола вперед, исследования и процедуры, чтобы позволить эволюцию штаммов дрожжей, способные выживать и эффективно функционировать использовать как гексозы и пентозы, в присутствии таких соединений, ингибирующих необходимы. Существенным дополнительным недостатком традиционных промышленных штаммов дрожжей, таких как Saccharomyces CEREVISIAE, является невозможность эффективного fermenт ксилозы имеющихся в гидролизатов биомассы растений.
Pichia stipitis штамма NRRL Y-7124 (CBS 5773), который недавно был переименован Scheffersomyces stipitis, является уроженцем пентозы брожения дрожжей , который хорошо известен брожение ксилозы в этанол. 2,3 Эволюция штамма NRRL Y-7124 преследовалась здесь , потому что было документально имеют наибольший потенциал нативных штаммов дрожжей для накопления экономически извлекаемые этанола более 40 г / л с небольшим количеством ксилита побочного продукта. 4,5,6 в оптимальном средах, С. stipitis штамм NRRL Y-7124 производит 70 г / л этанола в 40 ч (1,75 г / л / ч) с выходом 0,41 ± 0,06 г / г в культурах с высокой плотностью клеток (6 г / л клеток). 7,8 Сопротивление для ингибиторов ферментации этанол, фурфурол и HMF также сообщалось, 9 и С. stipitis занимает первое место среди наиболее перспективных родных пентозы брожения дрожжей , доступных для промышленного масштаба этанола костюмноп от лигноцеллюлозы. 10 Наша цель заключалась в применении разнообразных undetoxified лигноцеллюлозных гидролизатов и давления отбора этанола , чтобы заставить эволюцию к более надежной производной штамма NRRL Y-7124 , пригодного для промышленного применения. Ключевое место среди усовершенствованных функций искомых были более высокие скорости сахара поглощение в концентрированных гидролизатов, снижение diauxy для более эффективного использования смешанного сахара, а также более высокие допуски этанола и ингибиторов. Применение S. stipitis к undetoxified гидролизатов был одним из ключевых направлений исследований , чтобы исключить дополнительные операционные расходы , связанные с гидролизата процессов детоксикации, такие как overliming.
Две промышленно перспективных гидролизатов были применены к силе эволюции:. Фермента осахаривают аммиака волокна расширения предварительно обработанных гидролизат кукурузы Стовер (AFEX CSH) и разбавленной кислотой предварительно обработанный проса гидролизат ликер (PSGHL) 11,12 технология предварительной обработки AFEX разрабатывается с цельюсвести к минимуму образование ингибиторов ферментации, в то время как предварительная обработка разбавленная кислота, представляет текущую низкую стоимость технологии наиболее часто практикуется подвергать целлюлозной биомассы для ферментативного осахаривания. PSGHL отделима от целлюлозы, оставшегося после предварительной обработки и характерно богатая ксилозы из гидролизованного гемицеллюлозы, но с низким содержанием глюкозы. AFEX CSH и PSGHL композиции отличаются друг от друга в ключевых аспектах, которые эксплуатировались для управления процессом эволюции. AFEX CSH ниже в фурановых альдегидов и ингибиторы уксусной кислоты , но выше , в аминокислоты и источники азота , аммиака , по сравнению с PSGHL (таблица 1). PSGHL представляет дополнительную проблему ксилозы будучи преобладающим сахаром доступны. Таким образом, PSGHL целесообразно специально обогащают для повышения эффективности использования ксилозы в гидролизатов, слабость, предотвращающий коммерческое использование имеющихся дрожжей. Даже среди родных пентозы бродильных дрожжей, опора на неоптимальной сахара XyloSE для поддержки роста клеток и ремонт становится еще более сложной в гидролизатов из – за целого ряда причин:. недостаток питательных веществ, ингибиторов , вызывающих массовые повреждения клеток структурной целостности, а также нарушения в обмене веществ за счет окислительно – восстановительных дисбалансов 9 добавок азота, особенно в форме аминокислоты, могут представлять собой значительный эксплуатационные расходы для брожений. Влияние добавок азота на изолята скрининга и ранжирования был исследован с просо гидролизатов.
Улучшенные особи были обогащены в развивающейся популяции с использованием нескольких давления отбора зависит от естественного генетического разнообразия S. населения и мутации stipitis , индуцированный воздействием двух различных гидролизатов, этанол или УФ – излучения. Давление отбора были применены параллельно и последовательно исследовать ход эволюции в S. stipitis к желаемых производных , способных расти и брожение эффективно в гидролизатов(Рисунок 1). Повторяющиеся культивирование функциональных групп населения в более сложных гидролизатов было достигнуто в микропланшетах с использованием серии разведений либо 12% глюкан AFEX CSH или иначе PGSHL получают при 20% загрузки твердой фазы. Применение этанола роста заражали на ксилозы в непрерывной культуре дополнительно улучшена Afex CSH адаптированный населения путем обогащения для фенотипов, демонстрирующих меньшую восприимчивость к этанолу репрессию утилизации ксилозы. Последняя особенность недавно было показано , проблематично пентозы использования штаммом NRRL Y-7124 следуя ферментации глюкозы. 8 Обогащение на PSGHL была следующая изучить , чтобы расширить функциональные возможности гидролизата.
Предположительные улучшенные производные S. stipitis NRRL Y-7124 были выделены из каждой фазы процесса эволюции с использованием целевого обогащения в условиях стресса и разбавления покрытия , чтобы выбрать колонии из наиболее распространенных групп населения. безразмерная относительнаяПоказатели эффективности (RPIs) были использованы для ранжирования штаммов на основе общей производительности, где кинетическое поведение было оценено на различных типах гидролизата и пищевых добавок, применяемых. Хотя успехи различных процедур адаптации в целях улучшения функциональности S. stipitis в лигноцеллюлозных гидролизатов были ранее документированы, штаммы , демонстрирующих экономичного производства этанола на undetoxified гидролизатов не сообщалось ранее. 13-17 С использованием процедур эволюции визуализировать здесь более подробно, Slininger и др. 18 разработали штаммы, которые значительно улучшены по сравнению родительский штамм NRRL Y-7124 и способны производить> 40 г / л этанола в AFEX CSH и фермента осахаривают гидролизат проса (SGH) соответственно с добавлением источников азота. Эти новые штаммы представляют интерес для будущего развивающегося лигноцеллюлозы в этанол промышленности и в качестве субъектов дополнительных исследований в области геномики строительствана тех , кто ранее секвенировали штамма NRRL Y-11545. 19. геномика исследование верхних штаммов , полученных на различных этапах эволюции схематически на рисунке 1 бы пролить свет на историю генетических изменений , которые произошли в процессе развития в качестве прелюдии для дальнейших исследований по улучшению деформации.
Protocol
Representative Results
Discussion
Несколько шагов имеют решающее значение для успеха процесса эволюции. Во-первых, она является ключом, чтобы выбрать соответствующие давления отбора, чтобы вести эволюцию населения в сторону желаемых фенотипов, которые необходимы для успешного применения. Следующие селективные напря?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to express our sincere appreciation to Drs. Kenneth Vogel, Robert Mitchell and Gautam Sarath, Grain, Forage, and Bioenergy Research Unit, Agricultural Research Service, Lincoln, NE for their kind supply of switchgrass for this project. We also thank U.S. Department of Energy for funding to VB through the DOE Great Lakes Bioenergy Research Center (GLBRC) Grant DE-FC02-07ER64494.
Materials
| Cellic Ctec, Contains Xylanase (endo-1,4-) | Novozymes | No product number | www.novozymes.com, 1-919-494-3000 |
| Cellic Htec, Contains Cellulase and Xyalanase | Novozymes | No product number | www.novozymes.com, 1-919-494-3000 |
| Toasted Nutrisoy Flour | Archer Daniels Midland Co. (ADM) | 63160 | ADM, 4666 Faries Parkway, Decatur, IL 1800-37-5843 |
| Pluronic F-68 (Surfactant) | Sigma-Aldrich | P1300 | Sigma-Aldrich |
| Difco Vitamin Assay Casamino Acids | Becton Dickinson and Company | 228830 | multiple suppliers: e.g. Fisher Scientific, VWR, Daigger |
| D,L-tryptophan | Sigma-Aldrich | T3300 | multiple suppliers: e.g. Fisher Scientific, VWR, Daigger |
| L-cysteine | Sigma-Aldrich | C7352 | multiple suppliers: e.g. Fisher Scientific, Sigma-Aldrich |
| Bacto Agar | Becton Dickinson and Company | 214010 | multiple suppliers: e.g. Fisher Scientific, VWR, Daigger |
| Bacto Malt Extract | Becton Dickinson and Company | 218630 | multiple suppliers: e.g. Fisher Scientific, VWR, Daigger |
| Bacto Yeast Extract | Becton Dickinson and Company | 212750 | multiple suppliers: e.g. Fisher Scientific, VWR, Daigger |
| Peptone Type IV from soybean | Fluka | P0521-500g | multiple suppliers: e.g. Fisher Scientific, VWR, Daigger |
| Adenine, > 99% powder | Sigma-Aldrich | A8626 | CAS 73-24-5, Could use other brands. Multiple suppliers: e.g. Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC |
| Cytosine, > 99% | Sigma-Aldrich | C3506 | CAS 71-30-7, Could use other brands. Multiple suppliers: e.g. Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC |
| Guanine, SigmaUltra | Sigma-Aldrich | G6779 | CAS 73-40-5, Could use other brands. Multiple suppliers: e.g. Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC |
| Thymine, 99% | Sigma-Aldrich | T0376 | CAS 65-71-4, Could use other brands. Multiple suppliers: e.g. Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC |
| Uracil, 99% | Sigma-Aldrich | U0750 | CAS 66-22-8, Could use other brands. Multiple suppliers: e.g. Sigma-Aldrich, Acros Organics, MP Biomedicals LLC |
| Dextrose (D-Glucose), Anhydrous, Certified ACS | Fisher Chemical | D16-500 | CAS 50-99-7, Could use other brands. Multiple suppliers: e.g. Acros Organics, Fisher Scientific, MP Biomedicals, Sigma-Aldrich |
| D-Xylose, assay > 99% | Sigma-Aldrich | X1500 | CAS 58-86-6, Could use other brands. Multiple suppliers: e.g. Acros Organics, Fisher Scientific, MP Biomedicals, Sigma-Aldrich |
| 96-well, flat bottom plates | Becton Dickinson Falcon | 351172 | multiple suppliers: e.g. Thermo-Fisher, VWR, Daigger |
| Wypall L40 Wiper | Kimberly-Clark | towel in microplate boxes to absorb water for humidification; multiple suppliers: e.g. Thermo-Fisher, uline, Daigger | |
| Corning graduated pyrex flask, 125-mL, narrow opening (stopper #5) | Corning Life Science Glass | 4980-125 | multiple suppliers: e.g. Thermo-Fisher, VWR, Daigger |
| Innova 42R shaker/incubator, 2.5 cm (1") rotation | New Brunswick Scientific (1-800-631-5417) | M1335-0016 | multiple suppliers: e.g. Eppendorf, Thermo-Fisher. Other shaker/incubators with a 2.5 cm (1") throw could be used. |
| Duetz Cover clamp for 4 deepwell MTP plates | Applikon Biotechnology | Z365001700 | applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396 |
| Duetz System sandwich cover for 96 deepwell plates | Applikon Biotechnology | Z365001296 | applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396 |
| Duetz System silicone seal (0.8mm black low evap) for 96 deep well plate cover | Applikon Biotechnology | V0W1040027 | applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396 |
| Blue microfiber layer for Duetz system sandwich cover | Applikon Biotechnology | V0W1040001 | applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396 |
| 96 well, 2 mL square well pyramid bottom plates, natural popypropylene | Applikon Biotechnology | ZC3DXP0240 | applikon-biotechnology.com (U.S.), 1-650-578-1396 |
| Bellco 32mm silicon sponge plug closures, pk of 25 for 125-mL flasks | Bellco | 1924-00032 | Thomas Scientific, their Catalog number is 1203K27 |
| Bellco Spinner Flask, 1968-Glass Dome, Sealable Flange Type, 100-mL working volume. This design no longer manufactured. | Bellco | 1968-00100 (original Cat. No.) | Jacketed vessels have lower inlet & upper outlet ports for temp. control with circulating water bath. Vessels are 75mm in outer diam and 200mm in height. There are four side ports at ~45o angles and one top port. Port openings appropriate size for size 0 neoprene stoppers (21-22mm inner diameters on ports). |
| Mathis Labomat IR Dryer Oven | MathisAg | Typ-Nbr BFA12 215307 | Werner Mathis U.S.A. Inc. usa@mathisag.com, 704-786-6157 |
| Dual Channel Biochemistry Analyzer | YSI Life Sciences | 2900D-UP | www.ysi.com, robotic system for rapid sugars assay in 96-well microplate format |
| PowerWave XS Microplate Spectrophotometer | Bio-Tek Instruments, Inc | MQX200R | www.biotek.com |
References
- Perlack, R. D., Stokes, B. J. . Billion-Ton Update: Biomass Supply for a Bioenergy and Bioproducts Industry. , (2011).
- Prior, B. A., Kilian, S. G., duPreez, J. C. Fermentation of D-xylose by the yeasts Candida shehatae and Pichia stipitis. Process Biochem. 24 (1), 21-32 (1989).
- Kurtzman, C. P., Suzuki, M. Phylogenetic analysis of ascomycete yeasts that form coenzyme Q-9 and the proposal of the new genera Babjeviella, Meyerozyma, Millerozyma, Priceomyces and Scheffersomyces. Mcoscience. 51 (1), 2-14 (2010).
- Slininger, P. J., Bothast, R. J., Okos, M. R., Ladisch, M. R. Comparative evaluation of ethanol production by xylose-fermenting yeasts presented high xylose concentrations. Biotechnol. Lett. 7 (6), 431-436 (1985).
- Slininger, P. J., Bothast, R. J., Ladisch, M. R., Okos, M. R. Optimum pH and temperature conditions for xylose fermentation by Pichia stipitis. Biotechnol. Bioeng. 35 (7), 727-731 (1990).
- Slininger, P. J., et al. Stoichiometry and kinetics of xylose fermentation by Pichia stipitis. Annals NY Acad. Sci. 589, 25-40 (1990).
- Slininger, P. J., Dien, B. S., Gorsich, S. W., Liu, Z. L. Nitrogen source and mineral optimization enhance D-xylose conversion to ethanol by the yeast Pichia stipitis NRRL Y-7124. Appl. Microbiol. Biotechnol. 72 (6), 1285-1296 (2006).
- Slininger, P. J., Thompson, S. R., Weber, S., Liu, Z. L. Repression of xylose-specific enzymes by ethanol in Scheffersomyces (Pichia) stipitis and utility of repitching xylose-grown populations to eliminat diauxic lag. Biotechnol. Bioeng. 108 (8), 1801-1815 (2011).
- Slininger, P. J., Gorsich, S. W., Liu, Z. L. Culture nutrition and physiology impact inhibitor tolerance of the yeast Pichia stipitis NRRL Y-7124. Biotechnol. Bioeng. 102 (3), 778-790 (2009).
- Agbogbo, F. K., Coward-Kelly, G. Cellulosic ethanol production using the naturally occurring xylose-fermenting yeast, Pichia stipitis. Biotechnol. Lett. 30 (9), 1515-1524 (2008).
- Balan, V., Bals, B., Chundawat, S., Marshall, D., Dale, B. E. Lignocellulosic pretreatment using AFEX. Biofuels: Methods and protocols, Methods in Molecular Biology. 581, 61-77 (2009).
- Jin, M., Gunawan, C., Uppugundla, N., Balan, V., Dale, B. E. A novel integrated biological process for cellulosic ethanol production featuring high ethanol productivity, enzyme recycling, and yeast cells reuse. Energ. Environ. Sci. 5 (5), 7168-7175 (2012).
- Nigam, J. N. Development of xylose-fermenting yeast Pichia stipitis for ethanol production through adaptation on hardwood hemicellulose acid prehydrolysate. J. Appl. Microbiol. 90 (2), 208-215 (2001).
- Nigam, J. N. Ethanol production from wheat straw hemicellulose hydrolysate by Pichia stipitis. J. Biotechnol. 87 (1), 17-27 (2001).
- Hughes, S. R., et al. Random UV-C mutagenesis of Scheffersomyces (formerly Pichia) stipitis NRRL Y-7124 to improve anaerobic growth on lignocellulosic sugars. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 39 (1), 163-173 (2012).
- Bajwa, P. K., et al. Mutants of the pentose-fermenting yeast Pichia stipitis with improved tolerance to inhibitors in hardwood spent sulfite liquor. Biotechnol. Bioeng. 104 (5), 892-900 (2009).
- Bajwa, P. K., Pinel, D., Martin, V. J. J., Trevors, J. T., Lee, H. Strain improvement of the pentose-fermenting yeast Pichia stipitis by genome shuffling. J. Microbiol. Methods. 81 (2), 179-186 (2010).
- Slininger, P. J., et al. Evolved strains of Scheffersomyces stipitis achieving high ethanol productivity on acid- and base-pretreated biomass hydrolyzate at high solids loading. Biotechnol. Biofuels. 8:60, 1-27 (2015).
- Jeffries, T. W., et al. Genome sequence of the lignocellulosic-bioconverting and xylose-fermenting yeast Pichia stipitis. Nature Biotechnol. 25 (3), 319-326 (2007).
- Zabriski, D. W., Armiger, W. B., Phillips, D. H., Albano, P. A. Fermentation media formulation. Trader’s Guide to Fermentation Media Formulation. , 1-39 (1980).
- Syzbalski, W., Bryson, Y. Genetic studies on microbial cross resistance to toxic agents. I. Cross resistance of Escherichia coli to fifteen antibiotics. J. Biotechnol. 64 (4), 489-499 (1952).
- Klinke, H. B., Thomsen, A. B., Ahring, B. K. Inhibition of ethanol-producing yeast and bacteria by degradation products produced during pre-treatment of biomass. Appl. Microbiol. Biotechnol. 66, 10-26 (2004).
- Almeida, J. R. M., Bertilsson, M., Gorwa-Grauslund, M. F., Gorsich, S., Liden, G. Metabolic effects of furaldehydes and impacts on biotechnological processes. Appl. Microbiol. Biotechnol. 82, 625-638 (2009).
- Allen, S. A., et al. Furfural induces reactive oxygen species accumulation and cellular damage in Saccharomyces cerevisiae. Biotechnol. Biofuels. 3, (2010).
- Weisburger, J. H. Mutagenic, carcinogenic, and chemopreventive effects of phenols and catechols: the underlying mechanisms. ACS Symposium Series. 507, 35-47 (2009).
- Slininger, P. J., Dien, B. S., Lomont, J. M., Bothast, R. J., Ladisch, M. R. Evaluation of a kinetic model for computer simulation of growth and fermentation by Scheffersomyces (Pichia) stipitis fed D-xylose. Biotechnol. Bioeng. 111 (8), 1532-1540 (2014).
- Wang, X., et al. Comparative metabolic profiling revealed limitations in xylose-fermenting yeast during co-fermentation of glucose and xylose in the presence of inhibitors. Biotechnol. Bioeng. 111 (1), 152-164 (2014).
- Slininger, P. J., Branstrator, L. E., Bothast, R. J., Okos, M. R., Ladisch, M. R. Growth, death, and oxygen uptake kinetics of Pichia stipitis on xylose. Biotechnol. Bioeng. 37 (10), 973-980 (1991).
