This manuscript presents a unique in vitro model of immunopurified human villous cytotrophoblast cells cultured under hypoxia/reoxygenation. This model is suitable to study the protective effects of promising treatments, such as melatonin, on pregnancy complications associated with increased oxidative stress and altered placental function.
This protocol describes how villous cytotrophoblast cells are isolated from placentas at term by successive enzymatic digestions, followed by density centrifugation, media gradient isolation and immunomagnetic purification. As observed in vivo, mononucleated villous cytotrophoblast cells in primary culture differentiate into multinucleated syncytiotrophoblast cells after 72 hr. Compared to normoxia (8% O2), villous cytotrophoblast cells that undergo hypoxia/reoxygenation (0.5% / 8% O2) undergo increased oxidative stress and intrinsic apoptosis, similar to that observed in vivo in pregnancy complications such as preeclampsia, preterm birth, and intrauterine growth restriction. In this context, primary villous trophoblasts cultured under hypoxia/reoxygenation conditions represent a unique experimental system to better understand the mechanisms and signalling pathways that are altered in human placenta and facilitate the search for effective drugs that protect against certain pregnancy disorders. Human villous trophoblasts produce melatonin and express its synthesizing enzymes and receptors. Melatonin has been suggested as a treatment for preeclampsia and intrauterine growth restriction because of its protective antioxidant effects. In the primary villous cytotrophoblast cell model described in this paper, melatonin has no effect on trophoblast cells in normoxic state but restores the redox balance of syncytiotrophoblast cells disrupted by hypoxia/reoxygenation. Thus, human villous trophoblast cells in primary culture are an excellent approach to study the mechanisms behind the protective effects of melatonin on placental function during hypoxia/reoxygenation.
На протяжении всей человеческой беременности, плацентарные цитотрофобласта клетки, которые Мононуклеированные стволовые клетки, быстро пролиферируют и дифференцируются в или ворсинками или extravillous цитотрофобласта клеток. Extravillous cytotrophoblasts вторгнуться и реконструируют спиральные артерии стенки матки. Ворсинчатая cytotrophoblasts, с другой стороны, продолжают пролиферировать, дифференцироваться и сливаются в форме многоядерные syncytiotrophoblast (синцитии) 1. Содержание ворсинок трофобласта гомеостаза имеет важное значение для плода благополучия и здоровой беременности. На самом деле, ворсинчатые трофобласты позволяют обмен матери плоду кислорода и питательных веществ, а также произвести необходимые гормоны для беременности. Кроме того, syncytiotrophoblast является единственной типа клеток в прямом контакте с циркуляцией крови матери и обеспечивает существенную физическую и иммунологического барьера. Таким образом, syncytiotrophoblast должны подвергаться апоптозу и замену для поддержания гомеостаза и AVOID плацентарной патологии 2-5.
Методика , разработанная Kliman и др. , 6 в 1986 году выделить первичные ворсинчатых cytotrophoblasts из человеческих плацентами вызвало революцию в плацентарной исследований, позволяя изучение молекулярных механизмов , участвующих в ворсинок трофобласта дифференциации. Эта классическая методика, основанная на последовательных ферментативных варок с трипсина и ДНКазы, с последующим выделением в плотности центрифугирование среды (частицы коллоидного кремнезема покрыты поливинилпирролидона или Перколла) в настоящее время признается в качестве золотого стандарта для выделения ворсинчатых цитотрофобласта клеток. Этот метод может быть оптимизировано с помощью магнитной иммуноочистки, процедура, которая отделяет ворсинчатых cytotrophoblasts от не трофобласта клеток на основе дифференциальной экспрессии специфических антигенов на поверхности этих клеток. Мы выбрали человеческий лейкоцитарный антиген ABC (HLA-ABC) из-за отсутствия его экспрессии на клеточной трофобластическая мембранныхе 7,8.
Плацента является органом, который претерпевает значительные изменения в уровнях кислорода во время беременности. В первом триместре, отношение оксигенации является физиологически очень низкой (2% O 2) , но возрастает до умеренных уровней оксигенации (8% O 2) во втором и третьем триместре. Tuuli и др. 9 описано , что размножение в пробирке трофобласта среды внутри плацентарной ворсинок является проблемой и изменения в уровнях насыщения воды кислородом может даже привести к фенотипическим изменениям. Поэтому, предлагается принять 8% кислорода , как нормоксии , чтобы имитировать напряжение кислорода найденный в плацентарной ворсинок в третьем триместре беременности 8,9. Чен и др. 10 широко изучены несколько переменных , связанных с напряжением кислорода в культуре клеток трофобласта и продемонстрировали важность определения уровня кислорода в околоклеточном среде. Уровни кислорода в ворсинках имеют тенденцию к увеличениюиз-за васкулогенезе. Кровоток в плацентарных увеличивается ворсинок постоянно и уровень перекиси водорода (распространен по активные формы кислорода) является важным сигналом , который управляет васкулогенез 11,12. В осложнений во время беременности, отсутствие васкулогенезе порождает гипоксию, и что более важно, прерывистые вариации оксигенации (называемую гипоксию / реоксигенация). Эти условия приводят к ненормальному увеличению окислительного стресса, который ставит под угрозу плацентарного и жизнеспособности плода 13,14. Изменения , которые клетки трофобласта подвергаются в естественных условиях во время эпизодов гипоксии / реоксигенация может быть передразнил в пробирке следующим образом : ворсинчатые cytotrophoblasts поддерживаются при нормоксических условиях (8% O 2) , пока они не дифференцируются в syncytiotrophoblast. Они затем подвергаются гипоксических условиях (0,5% O 2) в течение 4 ч, а затем еще в течение 18 ч от нормоксии (реоксигенации). Используя эту гипоксия / реоксигенация подход, трофобласта ехHiBit дерегулированы окислительно – восстановительный статус и повышенные уровни внутреннего апоптоза 8, как было отмечено в некоторых осложнений во время беременности. Следовательно, это полезно в модели пробирке для оценки новых профилактических и терапевтических подходов для борьбы с осложнениями беременности , связанных с плацентарной гипоксия / реоксигенация.
Плацентарные клетки производят мелатонин, который имеет несколько важных функций, таких как способность устранени окислительного стресса и плацентарной дисфункции 15. Здесь мы приводим экспериментальные модели подход и клеточные , используемые для демонстрации защитных эффектов мелатонина в плацентарных клеток трофобласта на молекулярном, клеточном и функциональном уровне 8.
У млекопитающих, развитие плода напрямую зависит от адекватной плацентарной функции. Истоки развития нарушений здоровья основаны на гипотезе о том , что причиной заболеваний проявляются позже в жизни может быть прослежено к раннему развитию и что плацента имеет механистической роль ?…
The authors have nothing to disclose.
Supported by grants from the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) (no. 262011-2009) to CV and March of Dimes Social and Behavioral Sciences Research grant (#12-FY12-179) to CV and JTS; by studentships to LSF from the Ministère de l’éducation, de l’Enseignement supérieurs et de la recherche (MEESR)-Fonds de recherche du Québec (FRQ)-Nature et technologies (NT) and the Fondation Universitaire Armand-Frappier INRS, to HC from the Réseau Québécois en Reproduction-NSERC-CREATE, to AAHT from the Canadian Institutes of Health Research (CIHR) and FRQ-Santé, and to JBP from NSERC; by a fellowship to EMAS from the Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientìfico e Tecnològico (CNPq) and the Programme de bourses d’excellence pour étudiants étrangers MEESR-FRQNT.
Curved Metzenbaum Scissors | Shandon | 9212 | surgical equipment (cell isolation) (2 units) |
Splinter Forceps Fine 41/2in | Fisherbrand | 13-812-42 | surgical equipment (cell isolation) (2 units) |
Scissors 4.5 Str Dissection | Fisherbrand | 08-940 | surgical equipment (cell isolation) (2 units) |
Gauze Sponge 10cm X 10cm | Cardinal Health | 361020733 | |
Oblong Glass Baking Dish | Pyrex | 1105397 | Glassware (2.8L) |
Funnel Buchner | Coorstek Inc | 10-356E | Glassware (114MM DIAMeter) |
Watch Glass | pyrex | 9985100EMD | Glassware |
Formalin solution, neutral buffered, 10% | Sigma-Aldrich | HT501128-4L | histological tissue fixative solution |
Trypsinizing Flasks | Wheaton | 355395 | Glassware (1 unit) |
Disposable Culture Tubes | Kimble | 73750-13100 | Glassware |
Borosilicate Glass Pasteur Pipet (22.8 Cm) | Fisherbrand | K63B1367820C | Glassware |
250 Ml Glass Beakers | Fisherbrand | KFS14005250 | Glassware |
Glass Media Bottles With Cap | Fisherbrand | KFS14395250 | Glassware (8 units) |
50 Ml Corex Tube | Corning | 8422-A | (1 unit) |
15 Ml Polystyrene Centrifuge Tube | Corning | 430791 | |
50 Ml Polystyrene Centrifuge Tube | Corning | 430829 | |
10ml Serological Pipet | Corning | 11415038 | |
Cell Strainer 100μm Nylon | Corning | 431752 | |
Absorbant Liner | Scienceware | 1199918 | |
500 Ml Bottles Top Filter | Corning | Pore: 0,22 µm / medium and HBSS preparation | |
2 Ml Criogenic Vials | Corning | 430488 | |
Freezing Container, Nalgene Mr. Frosty | Sigma-Aldrich | C1562-1EA | |
Peristaltic Pump | Pharmacia Fine Chemicals | P3 model | |
Shaking Water Bath | Fisher | Model 127 | |
Vacuum Pump | ABM | 4EKFS6CX-4 | |
Sodium Chloride | Fisherbrand | EC231-598-3 | Saline solution 0.9% |
Hank’s Buffered Salt Solution (Hbss) | Sigma-Aldrich | H2387 | Quantity: 9.25 (one vial) for 1L of digestion solution |
Hydroxypiperazineethansulphonic Acid (Hepes) | Life Technologies | 15630-080 | 25mL (1M) for 1L of digestion solution |
Trypsin Type I | Sigma-Aldrich | T8003 | 9,888U |
Deoxyribonuclease Type Iv | Roche | 10-104-159-001 | 402,000U |
Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C4901 | 100mM |
Magnesium Sulfate | Baker | 2500-01 | 800mM |
Dulbecco’s Modified Eagle Medium High Glucose (Dmem) | Life Technologies | 10564-045 | |
Penicillin/Streptomycin Sulphate | Hyclone | SV30010 | |
Fetal Bovine Serum | Corning | 35-010-CV | |
Percoll | Sigma-Aldrich | P1644 | Density centrifugation media gradient. Volume: 36mL |
Isopropanol | Acros | 42383-0010 | 50mL |
Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | 472301 | |
Automacs Magnetic Separator | Miltenyi Biotec | Model 003 | |
Automacs Columns | Miltenyi Biotec | 130-021-101 | |
Automacs Running Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | http://www.miltenyibiotec.com/~/media/Images/Products/Import/0001100/IM0001131.ashx?force=1 |
Automacs Rinsing Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | http://www.miltenyibiotec.com/en/products-and-services/macs-cell-separation/cell-separation-buffers/automacs-rinsing-solution.aspx |
Anti-Human Hla Abc Purified Clone W6/32 | Affymetrix eBioscience | 14-9983-82 | anti-mouse antibody |
Anti Mouse Igg Microbeads | Miltenyi Biotec | 130048401 | |
Multiple Well Plate - 6 Well With Lid | Corning | 3335 | Cell Bind surface |
Multiple Well Plate - 24 Well With Lid | Corning | 3337 | Cell Bind surface |
Multiple Well Plate - 96 Well With Lid | Corning | 3300 | Cell Bind surface |
Modular Incubator Chamber | Billups-Rothenberg | MIC-101 | A set of two is necessary for simultaneous to generate normoxia and hypoxia/reoxygenation conditions |
Single Flow Meter | Billups-Rothenberg | SFM3001 | |
50 Mm In-Line Filter | Whatman | 6721-5010 | PTFE, pore: 1.0 µm |
Gas Regulator | Pro Star | PRS301233 | A set of two is necessary for simultaneous to generate normoxia and hypoxia/reoxygenation conditions |
Gas Hose Class Vi Clear 5/16 | Parker | 100-05070102 | 3 pieces with ~ 0.5 m |
17 Mm Adjustable Gas Hose Clamp | Tiewraps | THCSS-16 | |
Normoxia Gas Cylinder | Praxair | NI CDOXR1U-K | Size K (3rd trimester‘s composition: 5% CO2, 8% O2, Bal. N2) |
Normoxia Gas Cylinder | Praxair | NI CDOXR1U-K | Size K (3rd trimester‘s composition: 5% CO2, 0.5% O2, Bal. N2) |
Oxygen Microelectrode Mi-730 | Microelectrodes INC | 84477 | |
Oxygen Adapter | Microelectrodes INC | 3572 | |
ROS Detection Reagent: CM-H2DCFDA | Invitrogen | C-400 | |
β-hCG ELISA kit | DRG internatinal | EIA-4115 | |
Anti-Vimentin ourified antibody | eBioscience | 14-9897 | Host: mouse |
Anti-Cytokeratin 7 (FITC) antibody | Abcam | ab119697 | Host: mouse |
Alexa Fluor 488 Goat Anti-mousse IgG H&L antibody | Life Technologies | A-11029 |