Summary
Eine einfache Methode, primäre menschliche Plazenta (Villi) und dezidualen Organkulturen zu etablieren beschrieben. Villöse und dezidualen Organkulturen sind wertvolle Werkzeuge Pathogenese an der menschlichen Mutter und Fötus-Schnittstelle für das Studium. Eine Infektion mit dem Bakterium fakultativ intrazellulären Listeria monocytogenes nachgewiesen wird .
Abstract
Die Plazenta zeigt einen hohen Grad an Inter anatomischen Variabilität. Am besten Biologie und Pathophysiologie der menschlichen Plazenta zu verstehen, ist es zwingend notwendig, Experimente zu entwerfen menschlichen Zellen und Geweben verwendet. Ein Vorteil der Organkultur ist wartungs von dreidimensionalen (3D) strukturelle Organisation und der extrazellulären Matrix. Das Ziel des hier beschriebenen Verfahrens ist erfolgreiche Etablierung von ex vivo menschlichen Schwangerschaftsgewebe Organkulturen und ihre gesunde Kultur Pflege für 72-96 Std. Das Protokoll beschreibt die sofortige Verarbeitung der Forschung Zustimmung, Plazenta und dezidualen Proben frisch aus dem OP-Bereich. Diese sind reichlich Exemplare, die sonst weggeworfen würden. Eine detaillierte Anleitung zur sterilen Entnahme dieser Proben, einschließlich morphologischer Details darüber, wie geeignete Gewebe zu wählen 3D-Organkulturen zu etablieren, wird zur Verfügung gestellt. Plazentare Villi und dezidualen Gewebe microdissected in 2-3 mm 3 Stückund separat auf Matrix-lined Transwell-Filter und kultiviert für mehrere Tage gelegt. Villöse und dezidualen Organkulturen eignen sich gut für die Untersuchung von menschlichen Wirt-Pathogen-Interaktion. Im Vergleich zu anderen Modellorganismen sind diese menschlichen Kulturen besonders vorteilhaft Infektionsmechanismus für Krankheitserreger zu untersuchen, die variable Muster der Wirtsspezifität zeigen. Als Beispiel zeigen wir , Infektion von Plazenta- und dezidualen Organkulturen mit den klinisch relevanten, fakultativ intrazellulären bakteriellen Pathogen Listeria monocytogenes.
Introduction
Infektion und Entzündung an der Mutter und Fötus-Schnittstelle stellt eine wichtige Quelle von Morbidität und Mortalität bei Frauen und Kinder. Zu verstehen, wie Krankheitserreger diese Gewebe infizieren ist für die Entwicklung neuer Strategien kritisch zu verhindern und Krankheiten wie vorzeitige Wehen und Tod des ungeborenen Kindes zu behandeln. Allerdings hohe Inter Variabilität der Mutter und Fötus Schnittstelle erschwert experimentelle Untersuchung. Des Weiteren zeigen die meisten mikrobiellen Krankheitserregern Wirtsspezifität, kann so viele Tiermodelle nicht vollständig humanen Infektionskrankheiten rekapitulieren. Bestimmte Organismen (Haemophilus influenzae, Salmonellen typhi, Vibrio cholera, und viele andere) sind streng pathogene beim Menschen, während andere, wie Listeria monocytogenes, ein mittleres Niveau der Wirtsspezifität 1 zeigen. Wirtsspezifität hat sich in vielen Aspekten der Pathogenese dokumentiert, einschließlich der Kolonisation 2, Verbreitung 3, Immunevasion 4 5. Somit ist es äußerst wichtig, die optimale Wirtsmodellsysteme auszuwählen.
Bestehend aus fötalen Zellen und mütterlichen Blut, ist die Plazenta ein Organ , das 6 über den Verlauf der Schwangerschaft entwickelt sich schnell. Einfach ausgedrückt, ist die menschliche Plazenta von fetalen "zottig" baumartige Strukturen im mütterlichen Blut gebadet konstruiert. Gas und Nährstoffaustausch erfolgt über spezialisierte fötalen Zellschichten genannt Trophoblasten, die die Oberfläche der Villi Bäume säumen. Die mütterliche Gebärmutter-Schleimhaut, genannt Endometrium in der nicht-schwangeren Frauen, verwandelt sich strukturell und funktionell in die Dezidua die fetoplazentaren Einheit aufzunehmen. Villöse Bäume werden in die Gebärmutter durch extravillösen Trophoblasten (EVT) verankert, die aus Verankerungszellenspalten in der Dezidua migrieren. Die Mutter und Fötus-Schnittstelle, daher besteht aus Dezidua und Plazenta.
Die Orgelkultur hier beschriebene Technikwurde , wo und wie klinisch relevante menschliche Krankheitserreger, einschließlich L. zu untersuchen , verwendet monocytogene s und Toxoplasma gondii, passieren die Plazentaschranke 2,7. Diese ex vivo Organkulturen replizieren in vivo Gewebearchitektur und sind wohl physiologisch sehr Modellsysteme für die menschliche Placenta. Zusätzliche Kulturtechniken umfassen ganze Organ Explantate, Organscheiben und Gewebe oder Stammzell Organoiden eingebettet in 3D-Matrix. Weitere Informationen zu diesen Optionen finden Sie auf eine umfassende aktuelle Übersicht 8. Bitte beachten Sie, dass dieses Protokoll für die getrennte Kultur der Decidua und Plazentazotten ist. Für die Wechselwirkung zwischen Zellen und Plazenta Deciduazellen studieren, eine Co-Kultur-Technik bevorzugt sein. Wir verweisen den interessierten Leser auf die zuvor beschriebene Villi-dezidualen Co-Kultur - Technik verwendet , die von Forschern 9-11 trophoblast vermittelte dezidualen vaskuläre Remodeling zu studieren.
Protocol
Die Experimente wurden nach den Grundsätzen der Erklärung von Helsinki zum Ausdruck durchgeführt. Diese Studie wurde von der Institutional Review Board an der University of California, San Francisco (CHR # 11-05.530) zugelassen. Alle zur Verfügung gestellten Patienten für die Entnahme von Proben und die anschließende Analyse schriftliche Einverständniserklärung. Das Gewebe wurde als deidentifiziert Proben gesammelt.
HINWEIS: Der Forscher muss die Zustimmung ihrer institutionellen menschlichen Probanden Review Board erhalten. Der Ausschluss von Proben, basierend auf Gestationsdiabetes Geschichte oder der Plazenta Anomalien wird je nach den Bedürfnissen einer bestimmten Studie.
HINWEIS: Geeignete Sicherheitsbedingungen (Biosafety Level 2) sollte 12 für alle Schritte in diesem Protokoll verwendet werden.
1. Vorbereitung, vor Abholung Tag
- Autoklav strainers / Zange für die Sammlung, und Scheren / Zangen für Mikro-Dissektion.
- Bereiten Sie ausreichend Volumen (500 ml pro Probe) Waschpuffer (Refer Tabelle 1 für Rezept).
- Bereiten Sie ausreichend Volumen (100 ml pro Probe) von 0,22 um steril filtriert Sammlung Medien (siehe Tabelle 1 für Rezept).
- Aliquotieren extrazellulären Matrix (ECM, siehe Tabelle der Reagenzien für weitere Details) für die Langzeitlagerung.
- Shop ECM in fester Form bei -20 ° C. Für eine optimale Leistung zu vermeiden wiederholen Gefrier-Tau. Auftau Flasche zu einer viskosen Lösung auf 4 ° C, und 300 & mgr; l-Aliquots in einem kalten Raum mit gekühltem Pipettenspitzen herzustellen. Store Aliquots bei -20 ° C.
2. Sammlung von frischen Gewebe
ACHTUNG: Bei der mit frischem menschlichem Gewebe arbeiten Forscher allgemeine Vorsichtsmaßnahmen (OSHA) zur Verhinderung Übertragung von Bloodborne Pathogens folgen müssen und angemessene institutionelle Ausbildung erhalten haben. Persönliche Schutzausrüstung, einschließlich der Handschuhe, Augenschutz und Laborkittel sind notwendig.
- Transportautoklaviert-Schmutzfänger (eine pro Probe), autoklaviert-Zange, Waschpuffer (carboy), Sammlung Medien (25 ml pro Probe in einem 50 ml konischen Röhrchen), Sprühflasche, 10% Bleichmittel, 70% Ethanol, Gewebesammelschale, Sharpie und Eiskübel / Kühler ins Krankenhaus / Klinik.
HINWEIS: Die Proben werden in einem Forschungs bezeichneten Raum in einem Raum in der Nähe der Operationsbereich befindet empfangen. Eine sterile Gewebekultur Haube ist nicht erforderlich, aber Sammlung sollte rasch auf, und der Forscher sollten in geeigneter Flächen sanieren, wie unten beschrieben. - Platz carboy Waschpuffer neben dem Waschbecken, und Spray-Zapfen mit 10% Bleiche und 70% Ethanol. Platz Glasgewebeauffangschale auf der Lichtquelle (Licht-Pad oder Licht-Box) und Desinfizieren mit 10% Bleiche und 70% Ethanol. Lassen Sie an der Luft trocknen.
- Haben die Kliniker carry Proben aus dem OP-Bereich zur Probenvorbereitungsraum. An der Spüle, gießen Sie die Probe oben auf sterilen Hand Sieb gründlich Gewebe mehrmals in warh Puffer und übertragen gesamte Probe in einem Puffer zu hygienisiert Glasschale oben auf Lichtquelle.
HINWEIS: Beurteilung von Gewebe durch den Kliniker ist von höchster Priorität, so werden die folgenden Schritte nur dann durchgeführt, nachdem der Kliniker verbal angezeigt hat, dass er / sie die Bewertung beendet ist. - Verwenden einer sterilen Pinzette Plazentazotten und Decidua (2A und 3A) für die Sammlung auszuwählen, und übertragen 50 ml konische Röhrchen zu trennen. Beschriften Sie die Röhrchen mit Schwangerschaftsalter.
HINWEIS: Bevorzugte Schwangerschaftsalter von weniger als 9 Wochen und weniger als 16 Wochen für die Plazenta und Dezidua sind. In der Einrichtung wird nur ein Bruchteil jeder Probe zu Forschungszwecken beschafft, als ausreichend Gewebe für klinische pathologische Diagnose bleiben müssen. - Lagern und transportieren Probe auf Eis Forschungslabor.
- So sammeln Sie mehr als ein Exemplar, sterilisieren Sie die Glasschale als mit 10% Bleiche und 70% Ethanol zwischen dem colle oben beschriebenction jeder Probe.
3. Herstellung von Orgelkulturplatten
HINWEIS: Die folgenden Schritte in einer Gewebekultur Haube mit einer sterilen Technik durchgeführt werden sollte. Es ist ideal für das Binokular in einem sterilen Bereich befinden. Dies ist jedoch nicht zwingend notwendig, so lange wie Mikrodissektion zügig durchgeführt wird, und Instrumente werden häufig in 70% Ethanol getaucht.
- Thaw ECM Phiole (n) auf Eis. Verdünnen Sie das ECM 1: 1 mit eiskaltem Sammlung Medien, durch Pipettieren mischen. Pipette langsam Blasen Einführung zu vermeiden. Jede Vertiefung einer 6-Well-Gewebekulturplatte erfordert 100 ul dieser Suspension und wird 3-4 Organkulturen aufnehmen.
- Platz Transwell-Einsätze (Porengröße 0,4 & mgr; M) in jede Vertiefung 6-Well-Gewebekulturplatte.
- Coat jede Transwell-Einsatz mit einer dünnen Schicht (100 & mgr; l) des ECM / Medien Suspension.
- Legen Sie die Platte auf Eis und sofort gehen Sie zu Lokal, ein harmonischert von Organkulturen. Alternativ bereiten die Platte vor der Gewebesammlung, in welchem Fall es in para-Film und lagern bei 4 ° C für eine spätere Verwendung zu wickeln. Lagerung von mehr als 6 Stunden wird nicht empfohlen, da das ECM wird austrocknen.
4. Einrichtung von Organkulturen
Hinweis: Dieser Schritt wird beschrieben, wie dezidualen Organkulturen und zottig Organkulturen in getrennten Transwells zu platzieren. Die Gewebe werden nicht in Kontakt. Die Forscher interessieren sich für eine Co-Kultur - Technik , bei der Decidua und Zotten miteinander in direktem Kontakt sind, können auf dem Stand der Literatur 9,10 verweisen.
- Spülen Proben zweimal in Sammlung Medien und Zentrifuge bei 1000 × g zwischen jeder Spülung. Übertragen Sie Gewebe in eine sterile Petrischale und auf der Bühne von einem Binokular. Halten Sie 6-Well-Platte auf Eis neben dem Mikroskop.
- Micro-dissect Gewebe mit sterilen springer Dissektionsscheren und Zange, 2-3 mm villous Organkultur zu etablierens (2A).
HINWEIS: Villöse Organkulturen sind kleine, gut vaskularisierte "Bäume" mit 2 oder 3 Zweige und mit prominenten extravillösen trophoblast (EVT) Zellenspalten 11. Es ist wichtig , nur Zottengewebe von <9 Wochen des ersten Trimesters Proben, die Invasion von extravillösen Trophoblasten in ECM zu verwenden die meisten 13 in diesen jungen Jahren ausgesprochen. - Wählen Sie gut durchbluteten Zotten mit prominenten EVT Zellenspalten. EVT Zellenspalten werden als bauchige visualisiert, "fuzzy", "fluffy" endet (siehe Pfeile in 2A).
- Verwenden einer sterilen Pinzette zu übertragen 3 oder 4 villous Bäume in jeder Transwell. Stellen Sie Zweige so ist Baum flach oben auf ECM und separaten verklumpt Zweige positioniert.
- Mikro sezieren Decidua mit sterilem springer sezieren Schere und Pinzette, 3 mm 3 dezidualen Organkulturen zu etablieren (3A).
HINWEIS: Die Proben enthalten zwei distinct Arten von dezidualen Geweben, Decidua parietalis und Decidua capsularis (linke und rechte Gewebefragmente bzw. 3A). - Schneiden mit einer Schere zu schaffen 3 mm 3 Stück Decidua parietalis. Decidua capsulatis wird für diese Kulturen nicht verwendet. Verwenden einer Pinzette jede geronnenes Blut der Mutter zu necken entfernt.
- Verwenden einer sterilen Pinzette 3-4 Stücke von Decidua in jede Transwell zu übertragen.
- In 1 ml Sammlung Medien zu Boden des Bohrlochs. Inkubieren Platte über Nacht bei 37 ° C in 5% CO 2
- Für Experimente , bei denen es wichtig ist normaler Plazenta des ersten Trimesters Sauerstoffspannung zu simulieren, zu erhalten villous Organkulturen in relativen Hypoxie (3% O 2).
HINWEIS: Die Laboroptionen umfassen kleine Hypoxie Inkubatorkammern , die in passen bestehende Inkubatoren oder ein Tri-Gas - Inkubator , die externe N 2 -Gas führt Sauerstoffkonzentration zu senken. - 1 ml Villöse oder Deziduale Medium (Table 1) von Transwell nach 12-16 Stunden der Kultur nach oben.
HINWEIS: Das Fehlen von Medien während der ersten Nacht in Kultur ermöglicht die extravillösen Trophoblastenzelle Säulen (villous Kultur) einzufallen, und für das Gewebe (beide villous und dezidualen) sicher in ECM eingebettet zu werden. Unserer Erfahrung nach bleiben dezidualen Organkulturen rentabel 72 Stunden und zottig Organkulturen für 96 Stunden. Wir empfehlen experimentelle Endpunkte, die in diesem Zeitraum fallen. Siehe Tabelle 1 für Zusammensetzung von Villöse und Deziduale Medium. Villöse Medium hat einen hohen Anteil an FBS, während Deziduale Medium mit Schwangerschaftshormone ergänzt wird (Progesteron, 17β-Estradiol), die den decidualized Zustand (Tabelle 1) erhalten.
5. Herstellung von L. monocytogenes Kulturen
HINWEIS: Für detaillierte Protokoll über die langfristige Lagerung von L. monocytogenes und die Kultur und das Wachstum von this Organismus in Hirn - Herz - Infusion (BHI) Brühe und Agar, finden Sie in Wang et al. 14
- Wählen Sie eine einzelne L. monocytogenes Kolonie von gestreift BHI - Agar - Platte und impfen 3 ml BHI - Brühe.
- Inkubieren Sie die L. über Nacht monocytogenes - Kultur (16 Stunden), in einer schrägen Position, bei 30 ° C.
. HINWEIS: Diese Kulturbedingungen erlauben das Wachstum von Bakterien stationäre Phase zu erreichen L. monocytogenes wird bei 30 ° C, gegeißelt , die Wirtszelle Invasion 15 erhöht.
6. Die Infektion von Organkulturen mit L. monocytogenes
- Warme PBS und Villöse oder Deziduale Medium (Tabelle 1) auf 37 ° C.
- Verwenden Sie sterile Pinzette keine Organkultur Stücke zu entfernen, die nicht in das ECM hat einzudringen, und schweben daher in den Brunnen.
- Sorgfältig absaugen Medien von der Unterseite des Transwell. Spülen Sie obere und untere Transwells zweimal durch vorsichtiges Pipettieren 1 ml KriegM PBS in gut und dazwischen sorgfältig abgesaugt. Pipette vorsichtig 1 ml antibiotikafreien Villöse oder Deziduale Medien oberen und unteren Transwell. Achten Sie darauf, nicht die Organkultur zu stören.
- Lassen Sie das Gewebe in antibiotikafreiem Medium inkubiert mindestens eine Stunde, um sicherzustellen, dass Antibiotika entfernt wurden.
HINWEIS: Bei der stationären Phase die Dichte des L. monocytogenes - Kultur beträgt etwa 1 x 10 9 koloniebildenden Einheiten (CFU) pro ml. Die Anzahl der Bakterien verwendet, um Organkulturen infizieren sollte empirisch bestimmt werden experimentelle Bedürfnisse zu erfüllen. - Für Wildtyp L. monocytogenes zeigen Routine Infektionsversuche robust Invasion mit einer Verdünnung von 1:50 der über Nacht (4 x 10 7 L. monocytogenes in 1 ml Medium pro Vertiefung). Resuspendieren die entsprechende Anzahl von Bakterien in antibiotikafreien Villöse oder Deziduale Medium.
- Absaugen Medien von der Oberseite des Transwells. Sanft 1 ml Inoculum hinzufügen. Inkubiere Platten bei 37° C in 5% CO 2 für die bakterielle Invasion zu ermöglichen.
- Entfernen der extrazellulären Bakterien, die durch Medien aus oberen und unteren Transwells Absaugen. Spülen Sie Vertiefungen zweimal mit warmem PBS. 1 ml Villöse oder Deziduale ergänzten Medium mit 50 & mgr; g ml -1 Gentamicin. Inkubiere Platten bei 37 ° C in 5% CO 2.
HINWEIS: L. monocytogenes ist ein fakultativ intrazellulären Bakterien , die in das extrazelluläre Medium, wachsen innerhalb der Zellen, und die Ausbreitung von Zelle zu Zelle , ohne den Zugriff auf den extrazellulären Raum wachsen kann. Gentamicin besitzt eine bakterizide Wirkung auf extrazelluläre L. monocytogenes, und somit ermöglicht die Messung von intrazellulären L. monocytogenes Wachstum und durch die Orgelkultur 16 verteilt.
HINWEIS: Reproduzierbare L. monocytogenes Infektion von Villi und Decidua Organkulturen tritt mit 5 hr Inkubationszeiten. Die Zeit der Inkubation vor der Zugabe von Gentamicin modifiziert werden kann auf experimentelle Bedürfnisse basiert und der ab-ility des Organismus in das Gewebe eindringen. Zum besseren Verständnis der anatomischen Stellen besonders anfällig für Infektionen verstehen, kürzere Inkubationszeiten können 2 verwendet werden. - Pflegen Platten bei 37 ° C in 5% CO 2 für die Dauer des Experiments. Ändern Sie ganze Medien in jeder Vertiefung täglich.
HINWEIS: Nach unserer Erfahrung L. monocytogenes infiziertem dezidualen Organkulturen für 72 Stunden lebensfähig für 48 Stunden und zottig Organkulturen bleiben.
7. Ernte von Organkulturen für Histopathologie
- Eine frische Lösung von 4% Paraformaldehyd durch 10 ml einer 16% igen Stamm Ampulle verdünnt in 30 ml PBS. Store 4% Paraformaldehyd bei 4 ° C, vor Licht geschützt und innerhalb einer Woche verwenden. Auf Raumtemperatur bringen vor der Verwendung.
- Absaugen Medien von oberen und unteren Transwell. Spülen Sie vorsichtig Vertiefungen zweimal mit PBS bei Raumtemperatur. Sanft 1ml 4% Paraformaldehyd Transwell nach oben, um vollständig die Orgelkultur abdecken.
- bebrütenin 4% Paraformaldehyd für 20 min bei Raumtemperatur. Vermeiden längere Inkubationszeiten, da dies zu einer Über Fixierung des Gewebes führen könnten.
- Aspirat Paraformaldehyd und rinse Vertiefungen zweimal mit PBS bei Raumtemperatur. Einbetten der festen Organkulturen in OCT-Medium, einfrieren, und Abschnitt auf einem Kryostaten ( "fixed eingefroren"). Im Allgemeinen ist fixiert gefrorene Gewebe leichter Schnitt als gefrorene Gewebe ohne vorherige Fixierung.
HINWEIS: Für eine vollständige Protokoll auf Oktober Einbettung und gefrorene Schnitte, bitte relevanten Abschnitte aus den veröffentlichten Protokollen 17,18 zuzugreifen. Je nach experimentellen Anforderungen und verfügbaren Laborgeräten und Lagerung, Gewebe kann stattdessen sein Paraffin eingebetteten und auf einem Mikrotom 19 geschnitten. - Weitere Gewebeschnitte für Routine Hämatoxylin & Eosin - Färbung, Immunfluoreszenz oder Immunhistochemie 18,20,21 vorzubereiten.
Representative Results
Abbildung 1 (modifiziert nach Zeldovich- & Bakardjiev 22) Diagramme der entsprechenden Plazenta und Gebärmutter-Anatomie. Abbildung 2 zeigt repräsentative Brutto und histologische Bilder von Plazentazotten, während Abbildung 3 Decidua demonstriert.
Dieses Protokoll beschreibt zunächst die Sammlung von frischen Plazenta und Decidua im Krankenhaus oder einer Klinik. Die gesammelte Probe ist eine Mischung aus fötalen Plazenta (Zotten) und mütterlichen Uterus-Komponenten (Dezidua). Nachdem mit Puffer gespült Breitspektrum-Antibiotika und Antimykotika enthalten, wird die gesamte Probe durch das Auge mit der Lichtbox inspiziert. Villi und Dezidua werden in separaten Rohren und transportiert auf Eis ins Labor gebracht. Im Labor wird ein Binokular die feinen morphologischen Eigenschaften von gesundem Gewebe zu schätzen verwendet. Repräsentative Fotografienvillous (2A) und dezidualen Geweben (3A) , die mit einem Binokular mit zwei externen gooseneck Lichtquellen erworben wurden , werden als Referenz gezeigt.
Villöse Organkulturen werden aus ersten Trimester Proben erzeugt. Kulturen bestehen aus kleinen Terminal villous Bäume mit 2-6 Zweigen. Es ist wichtig, zottig Zweige zu sezieren, die in extravillösen trophoblast Spalten beenden und gut vaskularisiert sind. Diese Funktionen werden als "fluffy" oder "fuzzy" Zweigenden (Pfeilspitzen) zu sehen ist , und das schwache rosa-to-rot linearen Farbton , die Kurse durch die Zweige des Baumes auf der linken Seite in 2A. Im Gegensatz dazu Gefäßen und extravillösen Trophoblasten sind für den Baum auf der rechten Seite dieses Bildes nicht ohne weiteres sichtbar gemacht, die für die Kultur suboptimal wäre. Über den ersten Tag der Kultur, wandern die extravillösen Trophoblasten in das ECM, thus Verankerung der villous Bäume in die Matrix auf der Transwell.
Deziduale Organkulturen sind aus der ersten und frühen zweiten Trimester Proben erzeugt. Die gesamte Gebärmutterschleimhaut in Decidua umgewandelt sehr kurz nach der Implantation. Genauer gesagt definiert Dezidua basalis die Uterusschleimhaut direkt die Plazenta / Implantationsstelle zugrunde liegt, Decidua capsularis definiert Mukosa über dem Fötus und Dezidua parietalis bezieht sich auf den Rest der Gebärmutterschleimhaut. Visualisierung unter einem Binokular zeigt , dass die frühen Schwangerschafts Probe besteht zum größten Teil aus Dezidua parietalis und Decidua capsulatis (linke und rechte Gewebefragmente jeweils in 3A). Die Decidua capsulatis leicht zeichnet sich durch seine dünne, membranartige Natur. Für Organkulturen wird Decidua parietalis bis 3 mm getrimmt 3 Fragmente mit Mikro-Dissektion Schere und adhemieten geronnene Blut wird mit einer Pinzette entfernt.
Im Anschluss an Inkubation über Nacht werden Gewebe mit L. infiziert monocytogenes. Die Infektion oben beschriebenen Protokoll wird auf dem Gentamicin Protection Assay auf Basis verwendet , um intrazelluläre Wachstum und die Ausbreitung von fakultativ intrazellulären Bakterien 16 studieren. Organkulturen in antibiotikafreien Medium mit L. inkubiert monocytogenes für 5 Stunden. Kulturen werden mit sterilem PBS gewaschen Bakterien aus dem Medium zu entfernen. Danach wird Gentamycin zugesetzt extrazelluläre Organismen zu eliminieren. Vor Literatur aus unserem Labor verwendet Immunfluoreszenz und konfokale Mikroskopie bakteriellen Gewebelokalisierung zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion 2 zu bestimmen. Organkulturen werden in PBS, fixiert in 4% Paraformaldehyd und entweder eingefroren eingebettetem in OCT-Medium und gelagert bei -80 ° C, oder in Paraffin eingebettet und gelagert bei Raumtemperatur gespült. Gewebeschnitte können sta seinined für Immunofluoreszenz (IF) oder immunhistochemischen (IHC) Analyse von Bakterien und eukaryotische Zelle Lokalisierung. 2B ist ein Vertreter IF Bild eines gefrorenen Abschnitt aus einer Kultur bei 72 Stunden nach der Infektion villous Orgel 8,3 Wochen vorbereitet. Beachten Sie die schwere bakterielle Belastung (grüne Fluoreszenz) in den EVTs an den Enden der Villi Äste und den relativen Mangel an Bakterien in der Baum Futter Synzytiotrophoblasten (rote Fluoreszenz) Schicht. In früheren Arbeiten haben wir ähnliche IF - Färbung L. zu lokalisieren monocytogenes in villous Organkulturen zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Infektion. Über 72 h Infektion Ausbreitung von EVT in Unter Syncytial Cytotrophoblasten und die zugrunde liegenden Zottenstroma. Bemerkenswerterweise war die synyctiotrophoblast Schicht 2 auf eine Infektion resistent.
Repräsentative lichtmikroskopische Bilder von H & E-gefärbten Paraffin eingebetteten dezidualen Gewebeschnitte von 14,3 Wochen specime vorbereitetns sind in den 3B und 3C gezeigt. Diese ECM-beschichtete Transwell - Membran eingebettet wurde in situ (3B) , um die Organkultur zeigen. Das Bild zeigt epithelial ausgekleideten Drüsen (Stern) und Endothelzellen ausgekleideten Gefäßen (Diamant) positioniert heterogen innerhalb der dezidualen Stromazellen Fach. Darüber hinaus gibt es mütterlichen Immunzellen im ganzen dezidualen Stroma mit einer variablen Dichte gestreut. IHC und IF-Färbung kann verwendet werden bakterielle microanatomical Lokalisierung, relativ zu bestimmten resident Immunzellen zu bestimmen. Als Beispiel lokalisieren CD14 + Makrophagen (grüne Fluoreszenz) zur Auskleidung von Gefäßen und innerhalb des Stroma (Abbildung 3D) gestreut, während große Aggregate von L. monocytogenes (rote Fluoreszenz) beobachtet überwiegend im dezidualen Stroma bei 48 Stunden nach der Infektion (3D).
| Waschpuffer | Abscheidemediums | villöse Medium | deziduale Medium |
| PBS | DMEM / F-12 mit GlutaMAX | DMEM / F-12 mit GlutaMAX | DMEM / F-12 mit GlutaMAX |
| Penicillin 100 IU / ml | Fötales Rinderserum 2,5% | Fetal Bovine Serum 20% | Fötales Rinderserum 2,5% |
| Streptomycin 100 ug / ml | Penicillin 100 IU / ml | Penicillin 100 IU / ml | 17β-Estradiol 300 pg / ml |
| Gentamicin 50 ug / ml | Streptomycin 100 ug / ml | Streptomycin 100 ug / ml | Progesterone 20 ng / ml |
| Amphotericin B 1,25 & mgr; g / ml | Gentamicin 50 ug / ml | ||
| < / Td> | Amphotericin B 1,25 & mgr; g / ml |
Tabelle 1:. Medien Rezepte Komponenten und Konzentrationen für die Herstellung der Waschpuffer, Sammlung Medium, Villöse Medium und Deziduale Medium.
Abbildung 1. Plazentare Struktur. (A) Struktur der feto-plazentaren Einheit im mütterlichen Uterus, (B) Erweiterung der Box in (A) hebt hervor , dass fötale Trophoblasten (T) ausgekleidet Plazentazotten im mütterlichen Blut gebadet und in die Decidua verankert extravillösen Trophoblasten (EVT). Enthalten innerhalb Zotten sind fetalen Gefäße (FV), Fibroblasten und fötalen Makrophagen. Geändert von Zeldovich- & Bakardjiev 22. "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Villöse Organkulturen - Repräsentative Brutto und mikroskopische Bilder (A) Zwei Terminal villous Bäume mit einem Gestationsdiabetes Alter von 6 Wochen, als unter einem Binokular betrachtet.. Beachten Sie die "fluffy" Enden (Pfeilspitzen) und prominente Coursing fetalen Gefäßen durch die Zweige des Baumes auf der linken Seite, der dieses Stück für Orgel Kultur. (B) Immunfluoreszenzmikroskopie von Organkultur (Gestationsalter 8,3 Wochen) 72 Stunden nach der Infektion mit Listeria monocytogenes, Hervorhebungen schwere bakterielle Belastung [green] in extravillösen Trophoblasten. DAPI ist blau dargestellt, und & beta; HCG + Synzytiotrophoblasten in rot. Maßstabsbalken = 1 mm (A), 250 um (B).7 / 54237fig2large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3:. Deziduale Orgelkultur - Vertreter Brutto und mikroskopische Bilder (A) Decidua parietalis [links] und Decidua capsulatis [rechts] bei Gestationsdiabetes im Alter von 6 Wochen wie unter einem Binokular betrachtet. (B) H & E-gefärbten Abschnitt von 14,3 Wochen Gestationsalter Decidua parietalis Organkultur zeigt Drüsen und Gefäßen organisiert heterogen ganzen dezidualen Stroma. Die (Diamant, ◆) und das (Sternchen, *) markieren Vertreter Gefäß und Drüse sind. Brown Linie am unteren Rand ist Transwell-Membran, auf der Kante. (C) H & E-gefärbten Abschnitt von 14,3 Wochen Gestationsalter Decidua parietalis Organkultur bei höherer Vergrößerung demonstrates muskulären Wand Spirale in dezidualen Stroma eingebettet Arteriolen. Maternal Immunzellen sind klein mit dunklen runden Kernen und sind über das Stroma unregelmäßig verteilt. (D) Immunfluoreszenzmikroskopie von Organkultur 48 Stunden nach der Infektion mit L. monocytogenes, Hervorhebung große Zonen von Bakterien [rot] in dezidualen Stroma und mütterliche CD14 + Makrophagen [green] einen gewundenen Gefäßraum Futter und im Stroma verstreut. Maßstabsbalken = 1 mm (A), 250 & mgr; m (B), 50 & mgr; m (C und D). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Discussion
Angeboren, transgene und Knockout-Maus-Stämme können in experimentellen Systemen dienen robuste Mechanismen testen. Doch trotz der allgemeinen Erhaltung der Kern genetischen Materials, die funktionellen Genom von Mäusen und Menschen zeigen signifikante Unterschiede in der regulatorischen Elemente 23. Es ist nicht verwunderlich, dass die vielversprechenden präklinischen Studien in Tiermodellen sind manchmal nicht in menschlichen Patienten rekapituliert. Die Plazenta zeigt sehr hohe Inter diversity, damit Tiermodelle Rendering weniger als ideal für die Untersuchung der menschlichen Krankheit 24. In Anerkennung sowohl die bemerkenswerte Unterschiede in der Human- und Maus Immunologie 25 und die ausgeprägte unterschiedliche Entwicklung in der Plazenta Anatomie, ist es ratsam , die Verwendung von ex vivo Organkulturen von menschlichen Schwangerschaftsgewebe für die experimentelle Untersuchung zu prüfen.
Die Beschreibungen, fotografische Bilder und Lehr-Video in diesem Protokoll anweisen Forscher aufwie Villi und dezidualen Organkulturen auf ECM-beschichteten Transwell-Gewebekultureinsätze zu etablieren. Vorteile dieser Technik umfassen die relative Einfachheit der Mikrodissektion und mechanische Unterstützung Transwell-System, insbesondere im Vergleich zu alternativen Methoden wie 3D-Matrices eingebettet oder Organschnittkulturen. Die Aussetzung der Organkultur auf Membranträger ermöglicht Nährstoffaustausch auf allen Gewebeoberflächen und Lebensfähigkeit ist für Kurzzeitkultur (96 h für villous Kulturen, 72 h für dezidualen Kulturen) gehalten .Dieses Technik erlaubt im Gewebe menschlicher Plazenta Biologie studieren Ebene, unbestreitbar mehr biologisch relevanten als einschichtige Zellkulturmodellen.
Der wichtigste Schritt in diesem Protokoll ist die Mikro-Dissektion geeigneter Villi und dezidualen Stücke für Orgel Kultur. Optimale Gewebestücke werden demonstriert fotografisch (2A und 3A) zu unterstützen Forscher , für dieVisualisierung von Schwangerschafts-Proben ist neu. Es ist besonders wichtig villous Bäume, deren Äste enden in EVT Spalten auszuwählen, da diese Zellen in das ECM migrieren und helfen, die Zotten an der Membran zu verankern. Für beide Arten von Organkulturen ist hilfreich, Störungen des Gewebes während der Medienwechsel durch Pipettieren in einer sorgfältigen und gemächliche Art und Weise zu minimieren.
Diese Technik stellt nur minimale Schwierigkeiten. Gelegentlich zeigen Proben Kontamination. Die Kontamination ist in der Regel bakterielle (gelegentlich poly-mikrobiellen) und wird erst deutlich, nach 1-2 Tagen in Kultur. Sobald Kontamination beobachtet wird, sollte bleach angewendet werden, die Kultur verworfen und das Gewebekultur-Inkubator ein Langzeitproblem zu verhindern sterilisiert. Es gibt mehrere Möglichkeiten, eine Kontamination auftreten könnten: in utero-Infektion während der Operation, während der Proben Ernte / Verarbeitung oder während der Organkultur Wartung. Die Ernte und Verarbeitungsschritte sind die wahrscheinlichste Zeitund Platz für Verunreinigung eingeführt werden. Somit ist es wichtig, die Menge der Zeit zu verringern, die Probe während der Entnahme und Mikrodissektion manipuliert wird. Dies wird Probe Exposition gegenüber der Umgebungs, nicht sterilen Umgebung zu reduzieren. Je nach Laboraufbau kann das Binokular in der sterilen Gewebekultur Haube befinden.
Die histopathologische Analyse der Organkulturen nach Infektion mit dem medizinisch relevanten Erreger L. monocytogenes, wird als eine mögliche Anwendung des Protokolls hier gezeigt. Immunofluoreszenz Lokalisierung beider Bakterien und Wirtsimmunzellen nach der Infektion liefert neue Einblicke in den menschlichen Wirt Reaktion auf Krankheitserreger. Deziduale Organkulturen könnte als ergänzende ex vivo Experiment Technik dienen , um Daten aus in vivo - Maus - Infektionen erzeugt untersuchen, darunter faszinierende Berichte Defekte in murine dezidualen Makrophagen Abwehrfunktionen 26,27 zeigt. Zusätzlich menschliche orgeine Kulturen können in mixed-Infektionsstrategien, wie beispielsweise einem kompetitiven Inokulum verwendet werden , die aus mehreren isogenen Stämmen von L. monocytogenes. Competitive Infektion von Organkulturen ist eine sensible Weise die Relevanz von Virulenzfaktoren in den menschlichen Wirt zu testen. Eine Einschränkung dieses Verfahrens ist Lebensfähigkeit Gewebe, die Kurzzeitkultur (96 h für villous Kulturen, 72 h für dezidualen Kulturen) begrenzt ist. Dies ist ideal für eine Infektion mit schnell wachsenden Mikroben, wie L. monocytogenes, aber längere Kulturen können für Krankheitserreger notwendig sein , die mehr Zeit in Anspruch nehmen zu etablieren und durch das Gewebe ausbreiten.
Um die globale Belastung von Komplikationen während der Schwangerschaft zu reduzieren, müssen Forschung konzentriert sich auf das Verständnis der Pathophysiologie der menschlichen Mutter und Fötus-Schnittstelle. Bakterien-, Pilz- und virale Erreger, die von der Mutter überqueren den Feten Ursache Komplikationen während der Schwangerschaft und fetale Infektion verheerend. Kontrollierte in vivo Infektion von Labor aniMals wird in der Regel als der Goldstandard für die Adressierung , wie Krankheitserreger besiedeln und den Transit zwischen Organen 28. Da Plazenta Anatomie deutlich über Säugetierspezies variiert, ist es von größter Bedeutung, menschliches Gewebe zu Forschungsstrategien zu integrieren. Menschliche Villi und dezidualen Organkulturen sind sehr Modellsysteme Wirt-Pathogen-Wechselwirkungen zu untersuchen. Um diese wichtige noch schlecht verstanden Organ untersuchen, können die Forscher nutzen die Fülle von sonst verworfen menschlicher Plazenta und dezidualen Proben, Organkultur-Strategien wie hier beschrieben.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterilization pouches | Fisher Scientific | 01-812-54 | For autoclaving individual dissecting tools |
| Fine mesh strainer | Cuisinart (Amazon.com) | NA | Wrap completely in aluminum foil and autoclave prior to tissue collection. |
| Carboy with spigot | Fisher Scientific | 03-007-647 | For large volume preparation of Wash buffer. |
| Ice packs | Nortech labs | GB8818 | These do not have to be purchased, rather they can be recycled/reused from any routine laboratory shipment that includes them in the packaging. |
| 70% Ethanol | VWR | V1001 | 70% solution made by adding dH20 to 190 or 200 proof research grade alcohol. |
| 10% Bleach | Waxie Sanitary Supply | CLO 30966 | 10% solution made by adding dH20. |
| Light Box | Litebox Lumina (dickblick.com) | 55305-2009 | Note replacement bulbs also purchased on Blick (55305.0100) |
| Micro dissecting forceps | Stoelting | 52102-43 | 4 inches, 1 x 2 x 0.5 mm3, Slight Curve |
| Micro dissecting forceps | Stoelting | 52102-06 | 4 inches, Straight Fine, Sharp |
| Micro dissecting vannas spring scissors | Stoelting | 52130-01P | McPherson-Vannas Spring Scissors, 8.5 cm, 0.33 Tip, Slight Curve |
| Dissecting microscope | Leica Microsystems | MZ16 or M60 | We have had success with the listed models. External gooseneck flexible light sources are helpful but not necessary. |
| 50 ml conical tubes | Sigma-Aldrich (Corning) | CLS4558 | |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 10010023 | We purchase from our university Tissue Culture Core facility, alternate options such as this are available. |
| 10x Phosphate Buffered Saline | Teknova | P0195 | For preparation of Wash buffer we use 10x PBS |
| DMEM/F-12 nutrient mixture (Ham's) with GlutaMAX | Gibco (Life Technologies) | 10565-018 | We purchase this specific media formulation, containing 2.438 g/L sodium bicarbonate, 55 mg/L sodium pyruvate, and 4.5 g/L glucose |
| Gentamicin | Thermofisher Scientific | 15710072 | 1, 000x stock. Recommend to prepare and store aliquots at -20 °C to avoid freeze/thaw. |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 15140-122 | 100x stock. Recommend to prepare and store aliquots at -20 °C to avoid freeze/thaw. |
| Amphotericin B | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 15290-018 | 500x stock. Recommend to prepare and store aliquots at -20 °C to avoid freeze/thaw. |
| progesterone | Sigma-Aldrich | P8783 | A 1 mM stock solution is made by reconstituting 15.7 mg progesterone powder in 15.7 ml Ethanol and adding 34.3 ml PBS. Solution is sterile filtered, aliquoted, and stored at -20 °C. |
| 17β-estradiol | Sigma-Aldrich | E2758 | A 10 μM stock solution is made by reconstituting 13.5 mg estradiol powder in 10 ml ethanol and adding 40 ml PBS. Solution is sterile filtered, aliquoted, and stored at -20 °C. |
| Bottle-top vaccum filter (0.22 μm) | Sigma-Aldrich (Corning) | CLS430769 | For sterile filtration of Collection media after preparation |
| 6-well tissue culture plate | BD Falcon | 353224 | Polystyrene, Tissue culture treated |
| 6-well transwells | Millipore | PICM03050 | Insert - 30 mm diameter, 0.4 μm pore size hydrophilic PTFE membrane |
| Extracellular Matrix (for example, Matrigel Matrix) | BD Biosciences | 354234 | We have utilized Matrigel Matrix in our studies. It is a solid at room temperature and at -20 °C. Avoid repeat freeze/thawing. Thaw bottle to viscous solution at 4 °C, and prepare ~ 300 μL aliquots in the cold room with chilled pipette tips. Store aliquots at -20 °C. |
| Paraformaldehyde, 16% w/v aqueous solution | Alfa Aesar | 30525-89-4 | For tissue fixation, a fresh preparation of 4% paraformaldehyde is made by diluting this stock in PBS. |
| Tissue culture incubator, maintained at 37 °C, 5% CO2, 3% oxygen (optional for villous organ cultures) | For some experiments, hypoxia may be preferred. This can be established multiple ways, including addition of exogenous nitrogen via gas cylinder, Tygon tubing, and a regulator. | ||
| Bench top centrifuge |
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