Summary

Выделение Периваскулярный мультипотентных предшественников клеточных популяций из человеческой ткани сердца

Published: October 08, 2016
doi:

Summary

Человеческой сердечной ткани укрывает мультипотентных популяции клеток-предшественников периваскулярные, которые могут быть пригодны для регенерации миокарда. Техника , описанная здесь , позволяет одновременно выделения и очистки двух мультипотентных клеточных популяций стромы , связанных с носителями кровеносных сосудов, т.е. CD146 + CD34 перицитов и CD34 + CD146 адвентициальных клетки, из миокарда человека.

Abstract

Multipotent mesenchymal stem/stromal cells (MSC) were conventionally isolated, through their plastic adherence, from primary tissue digests whilst their anatomical tissue location remained unclear. The recent discovery of defined perivascular and MSC cell marker expression by perivascular cells in multiple tissues by our group and other researchers has provided an opportunity to prospectively isolate and purify specific homogenous subpopulations of multipotent perivascular precursor cells. We have previously demonstrated the use of fluorescent activated cell sorting (FACS) to purify microvascular CD146+CD34 pericytes and vascular CD34+CD146 adventitial cells from human skeletal muscle. Herein we describe a method to simultaneously isolate these two perivascular cell subsets from human myocardium by FACS, based on the expression of a defined set of cell surface markers for positive and negative selections. This method thus makes available two specific subpopulations of multipotent cardiac MSC-like precursor cells for use in basic research and/or therapeutic investigations.

Introduction

Сердце уже давно считается постмитотическими орган. Однако недавние исследования показали наличие ограниченного оборота кардиомиоцитов у взрослых человеческих сердец 1. Родные стволовые клетки / клетки – предшественники с кардиомиоцитов дифференцировке также были определены в миокарде у взрослых грызунов и человеческие сердца, в том числе Sca-1 +, C-Kit +, cardiosphere-формирующей, и совсем недавно, периваскулярные клетки – предшественники 2,3. Эти клетки представляют привлекательными кандидатами для терапии , направленных на повышение сердечного восстановления / регенерации через трансплантации клеток или стимуляции пролиферации на месте.

Мезенхимальных стволовых / стромальных клеток (МСК) были выделены из почти каждой ткани человека 4,5 Клинические испытания терапевтических применений MSC были проведены для нескольких патологических состояний , таких как сердечно – сосудистые ремонта 6, трансплантат против хозяина заболевания 7 </sup>, И цирроз печени 8. Благоприятные эффекты были приписаны способности к MSCs: дома к местам воспаления 9; дифференцироваться в различные типы клеток 10; секретируют про-репаративных молекул 11; и модулировать иммунные реакции хозяев 12. Изоляция MSCs традиционно полагались на их преимущественной соблюдения пластиковых подложках. Тем не менее, в результате популяция клеток , как правило , заметно гетерогенным 13. При использовании флуоресцентного активированной сортировки клеток (FACS) с комбинацией ключевых маркеров периваскулярных клеток, мы смогли выделить и очистить мультипотентных MSC-как население предшественника (CD146 + / CD31 / CD34 / CD45 / CD56 -) от несколько человеческих тканей , включая взрослых скелетных мышц и белого жира 14.

Периваскулярные клеточные популяции в различных несердечных тканей было показано, что имеют свойства стволовых / прогениторных кювета системые исследуются для клинического применения в сердечно-сосудистой обстановке. Перициты, один из самых известных околососудистых подмножеств клеток, являются гетерогенной популяции , которые играют несколько ролей патофизиологические в том числе в разработке новых судов 15, регулирование кровяного давления 16, и поддержание целостности сосудов 17,18. Как было показано во многих тканях, специфические подмножества перицитами изначально выразить MSC антигены и поддерживать их MSC-подобные фенотипы в первичной культуре после FACS очистки 14. Кроме того, эти клетки стабильно сохраняют свои долгосрочные фенотипов внутри культуры и демонстрируют несколько клонов дифференциации потенциал, похожий на MSCs 19,20. Эти результаты свидетельствуют о том, что перицитов являются одним из истоков неуловимого MSC 14. Терапевтический потенциал перицитов было продемонстрировано с сокращением миокарда рубцевания и расширение функции сердца после трансплантации в ишемией ранениясердца 21. В последнее время мы успешно очищают перицитов из миокарда человека и продемонстрировали свои МСЦ-как фенотипы и мультипотентность (липогенез, хондрогенезе и остеогенез) при отсутствии скелетной миогенезе 3. Кроме того, инфаркты перицитов выставлены дифференциальные cardiomyogenic потенциал и развитие кровеносных сосудов потенциала по сравнению с аналогами, очищенных из других органов.

Вторая популяция мультипотентных периваскулярных стволовых клеток / клеток – предшественников, в адвентиции клетки, был выделен из подкожных вен человека на основе выражения 22 положительным CD34. Венозные адвентициальные клетки , как было показано , чтобы иметь потенциал, клоногенных мезодермального способность дифференциации и проангиогенные потенциал в пробирке. Трансплантация этих клеток в ишемией сердца травмированных мышей привело к уменьшению интерстициального фиброза, увеличение ангиогенеза и кровотока миокарда, снижение желудочковой разбавленнойвания, а также увеличение сердечного выброса фракция 23. Интересно отметить , что жировая адвентициальные клетки было показано , что теряют экспрессию CD34 и CD146 выражение апрегулируются в культуре в ответ на лечение Ангиопоэтинподобный II, что предполагает принятие перицитов фенотипа при стимуляции 24. В сердце, тем не менее, адвентиции популяция клеток еще не перспективно очищают FACS и / или хорошо охарактеризованы. Используя процедуры выделения клеток, описанных в следующих разделах, мы в настоящее время характеризующие инфаркты адвентициальных клетки и исследовать их потенциал для регенеративной приложений.

Здесь мы опишем способ выделения и очистки двух субпопуляций периваскулярными стволовых клеток / клеток-предшественников из эмбриона человека или взрослого миокарда. Этот метод выделения проспективное клеток позволит исследователям получить изогенных периваскулярные подмножества стволовых / прогениторных клеток из биопсий сердца человека для проведения сравнительных исследований и furtheR исследовать их терапевтический потенциал в различных сердечных патологических состояниях.

Protocol

1. Обработка человеческого кардиохирургии образца Убедитесь, что все жидкости, контейнеры, инструменты, а также специализированный оперативной области являются стерильными. Поместите образец ткани сердца (закупленные банка тканей или хирургической бригады) в запоминающей…

Representative Results

Отдельные клетки отличались от мусора и дублетов на основе распределений вперед и бокового рассеяния. Живые клетки были идентифицированы по их непринятие до красителя DAPI. Стратегия стробирования была выбрана на основе управления изотипическим маркировки этого живо…

Discussion

Растущие доказательства поддерживает ограниченную регенеративную способность взрослого сердца человека после травмы. Идентификация и характеристика нативных клеток-предшественников, ответственных за такие регенеративных реакций в травмированных сердцах имеют решающее значение ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors wish to thank Shonna Johnston, Claire Cryer, Fiona Rossi and Will Ramsay at the University of Edinburgh and Alison Logar and Megan Blanchard at the University of Pittsburgh for their expert assistance with flow cytometry. We also wish to thank Anne Saunderson and Lindsay Mock for their help with obtaining human tissues. Human adult and fetal heart tissue samples were procured with full ethics permission of the NHS Scotland Tayside Committee on Medical Research Ethics and the NHS Lothian Research Ethics Committee (REC08/S1101/1) respectively. This work was supported by grants from the Medical Research Council (BP), British Heart Foundation (BP), Commonwealth of Pennsylvania (BP), Children’s Hospital of Pittsburgh (BP), National Institute of Health R01AR49684 (JH) and R21HL083057 (BP), and the Henry J. Mankin Endowed Chair at University of Pittsburgh (JH). JEB was supported by a British Heart Foundation Centre of Research Excellence doctoral training award (RE/08/001/23904). WC was supported in part by an American Heart Association predoctoral fellowship (11PRE7490001).

Materials

AbC Anti-mouse Bead Kit Molecular Probes A-10344
Collagenase I Gibco 17100-017 Reconstitute powder as required and filter sterilise
Collagenase II Gibco 17101-015
Collagenase IV Gibco 17104-019
anti-human CD34-PE BD Pharmingen 555822 Keep sterile
anti-human CD45-APC-Cy7 BD Pharmingen 557833 Keep sterile
anti-human CD56-PE-Cy7 BD Pharmingen 557747 Keep sterile
anti-human CD144-PerCP-Cy5.5 BD Pharmingen 561566 Keep sterile
anti-human CD146-AF647 AbD Serotec MCA2141A647 Keep sterile
EGM2-BulletKit Lonza CC-3162 For collection of cells and culture until adhered
DMEM, high glucose, GlutaMAX without sodium pyruvate ThermoFischer Scientific 10566-016
Fetal Bovine Serum ThermoFischer Scientific 10500-064 Freeze in aliquots and keep sterile
Gelatin Sigma Aldrich G1393 Dilute with sterile water
IgG1k-PE BD Pharmingen 559320 Keep sterile
IgG1k-APC-Cy7 BD Pharmingen 557873 Keep sterile
IgG1k-PE-Cy7 BD Pharmingen 557872 Keep sterile
IgG1k-PerCP-Cy5.5 BD Pharmingen 561566 Keep sterile
IgG1k-647 AbD Serotec MCA1209A647 Keep sterile
Mouse serum Sigma Aldrich M5905 Keep sterile
Paraffin Film – Parafilm M Sigma Aldrich P7793
Penicillin-Streptomycin Gibco 15979-063 Freeze in aliquots and keep sterile
Phosphate buffered saline pH 7.4 ThermoFischer Scientific 10010-023 Keep sterile
Red Blood Cell Lysing Buffer Hybri-Max Sigma Aldrich R7757 Keep sterile
Trypan Blue Solution Sigma Aldrich T8154
Trypsin-EDTA 0.5%(10X) Invitrogen 15400-054
 FACSARIA FUSION BD Pharmingen Fluorescence Activated Cell Sorter

References

  1. Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science (New York, N.Y.). 324 (5923), 98-102 (2009).
  2. Laflamme, A., Murry, C. E. Heart regeneration. Nature. 473 (7347), 326-335 (2011).
  3. Chen, W. C. W., et al. Human myocardial pericytes: multipotent mesodermal precursors exhibiting cardiac specificity. Stem cells (Dayton, Ohio). 33 (2), 557-573 (2015).
  4. Campagnoli, C., Roberts, I. A., Kumar, S., Bennett, P. R., Bellantuono, I., Fisk, N. M. Identification of mesenchymal stem/progenitor cells in human first-trimester fetal. Blood. 98 (8), 2396-2402 (2001).
  5. Zuk, P. A., et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Molecular biology of the cell. 13 (12), 4279-4295 (2002).
  6. Chen, S., et al. Effect on left ventricular function of intracoronary transplantation of autologous bone marrow mesenchymal stem cell in patients with acute myocardial infarction. The American journal of cardiology. 94 (1), 92-95 (2004).
  7. Ringdén, O., et al. Mesenchymal stem cells for treatment of therapy-resistant graft-versus-host disease. Transplantation. 81 (10), 1390-1397 (2006).
  8. Kharaziha, P., et al. Improvement of liver function in liver cirrhosis patients after autologous mesenchymal stem cell injection: a phase I-II clinical trial. European journal of gastroenterology & hepatology. 21 (10), 1199-1205 (2009).
  9. Spaeth, E., Klopp, A., Dembinski, J., Andreeff, M., Marini, F. Inflammation and tumor microenvironments: defining the migratory itinerary of mesenchymal stem cells. Gene therapy. 15 (10), 730-738 (2008).
  10. Yan, X., et al. Injured microenvironment directly guides the differentiation of engrafted Flk-1(+) mesenchymal stem cell in lung. Experimental hematology. 35 (9), 1466-1475 (2007).
  11. Van Poll, D., et al. Mesenchymal stem cell-derived molecules directly modulate hepatocellular death and regeneration in vitro and in vivo. Hepatology (Baltimore, Md.). 47 (5), 1634-1643 (2008).
  12. Popp, F. C., et al. Mesenchymal stem cells can induce long-term acceptance of solid organ allografts in synergy with low-dose mycophenolate. Transplant immunology. 20 (1-2), 55-60 (2008).
  13. Li, Z., Zhang, C., Weiner, L. P., Zhang, Y., Zhong, J. F. Molecular characterization of heterogeneous mesenchymal stem cells with single-cell transcriptomes. Biotechnology advances. 31 (2), 312-317 (2013).
  14. Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell stem cell. 3 (3), 301-313 (2008).
  15. Ozerdem, U., Stallcup, W. B. Early contribution of pericytes to angiogenic sprouting and tube formation. Angiogenesis. 6 (3), 241-249 (2003).
  16. Rucker, H. K., Wynder, H. J., Thomas, W. E. Cellular mechanisms of CNS pericytes. Brain research bulletin. 51 (5), 363-369 (2000).
  17. Betsholtz, C. Insight into the physiological functions of PDGF through genetic studies in mice. Cytokine & Growth Factor Reviews. 15 (4), 215-228 (2004).
  18. Gerhardt, H., Betsholtz, C. Endothelial-pericyte interactions in angiogenesis. Cell and tissue research. 314 (1), 15-23 (2003).
  19. Crisan, M., Chen, C. W., Corselli, M., Andriolo, G., Lazzari, L., Péault, B. Perivascular multipotent progenitor cells in human organs. Annals of the New York Academy of Sciences. 1176, 118-123 (2009).
  20. Kang, S. G., et al. Isolation and perivascular localization of mesenchymal stem cells from mouse brain. Neurosurgery. 67 (3), 711-720 (2010).
  21. Chen, C. W., et al. Human pericytes for ischemic heart repair. Stem cells (Dayton, Ohio). 31 (2), 305-316 (2013).
  22. Campagnolo, P., et al. Human adult vena saphena contains perivascular progenitor cells endowed with clonogenic and proangiogenic potential. Circulation. 121 (15), 1735-1745 (2010).
  23. Katare, R., et al. Transplantation of human pericyte progenitor cells improves the repair of infarcted heart through activation of an angiogenic program involving micro-RNA-132. Circulation research. 109 (8), 894-906 (2011).
  24. Corselli, M., Chen, C. W., Sun, B., Yap, S., Rubin, J. P., Péault, B. The Tunica Adventitia of Human Arteries and Veins As a Source of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells and Development. 21 (8), 1299-1308 (2012).
  25. Crisan, M., et al. Purification and long-term culture of multipotent progenitor cells affiliated with the walls of human blood vessels: myoendothelial cells and pericytes. Methods in cell biology. 86, 295-309 (2008).

Play Video

Cite This Article
Baily, J. E., Chen, W. C., Khan, N., Murray, I. R., González Galofre, Z. N., Huard, J., Péault, B. Isolation of Perivascular Multipotent Precursor Cell Populations from Human Cardiac Tissue. J. Vis. Exp. (116), e54252, doi:10.3791/54252 (2016).

View Video